肝脏是维持人体健康的重要器官,随着人们生活方式的改变,越来越多的危险因素可导致肝脏不同程度的损伤,并进一步引发一系列肝脏相关疾病包括肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌等,严重威胁着人类的生命健康。因此,实现早期诊断或治疗肝脏损伤对于有效预防和控制肝脏相关疾病的发展至关重要。在本课题研究中,我们基于鲁米诺键合α-环糊精（α-cyclodextrin,α-CD）成功构建了髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）生物响应性发光纳米粒（LaCD NP）,并用于中性粒细胞介导的酒精性肝损伤（Alcohol liver injury,ALI）和急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）小鼠模型的成像和治疗。LaCD NP的发光强度与活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）水平及MPO活性密切相关,在酒精引起的酒精性肝损伤和CCl₄引起的急性肝衰竭小鼠模型中,LaCD NP可以有效检测肝脏损伤并精确定量和追踪肝脏的中性粒细胞动态和数量,其发光强度变化与中性粒细胞、MPO水平以及其他与肝损伤发展相关的参数随时间的变化一致。同时,LaCD NP也可以通过清除高水平ROS,抑制巨噬细胞和中性粒细胞迁移以及抑制中性粒细胞MPO,IL-8,TNF-α和IL-1β的分泌实现ALI和ALF的有效治疗。体内外实验也证实了LaCD NP具有较好的生物安全性。方法1.基于鲁米诺键合α-环糊精发光材料LaCD的合成与表征在氮气保护下,α-CD的羟基首先被CDI活化形成中间体CDI-α-CD,然后通过酰胺键键合鲁米诺形成LaCD。随后,对LaCD进行FT-IR,¹H NMR,¹³C NMR和MALDI-TOF-MS结构表征及紫外可见光谱表征。2.基于鲁米诺键合α-环糊精发光纳米粒LaCD NP的制备和表征LaCD溶解于DMF中,逐渐滴加去离子水,通过纳米沉淀自组装形成纳米粒LaCD NP。改变溶剂比例、反应温度、反应时间,制备不同粒径大小的LaCD NP。按同样的方法,分别制备负载荧光染料Cy5和Cy7.5的LaCD NP（Cy5/LaCD NP和Cy7.5/LaCD NP）。随后,对制备的不同纳米粒进行形态及粒径表征。3.LaCDNP的体外稳定性及水解特性将制备的LaCD NP溶于去离子水和含血清培养基中,检测其稳定性变化;溶于不同浓度的H₂O₂和NaClO溶液以及不同pH溶液中,检测其水解变化,并对水解产物进行¹H NMR及MALDI-TOF-MS结构表征。4.LaCD NP的体外发光性能利用光纤光谱仪、微弱化学发光测量仪和IVIS活体成像系统从体外光谱学行为、体外发光行为以及体外成像能力考察LaCD NP在不同ROS环境下的体外发光性能。5.中性粒细胞吞噬LaCD NPBalb/c雌性小鼠腹腔注射1 mL 3%巯基乙酸盐溶液,4 h后,提取腹腔中性粒细胞,Cy5/LaCD NP与中性粒细胞孵育不同时间后,利用激光共聚焦显微镜定性观察吞噬行为,并通过流式细胞仪进行定量检测。按同样的方法,分析中性粒细胞吞噬不同剂量的LaCD NP。6.LaCD NP在中性粒细胞中的成像PMA刺激中性粒细胞,加入DCFH-DA,激光共聚焦显微镜观察ROS变化,ELISA试剂盒测定MPO含量。取黑色96孔板,PMA刺激中性粒细胞后,在不同条件下,加入LaCD NP于IVIS成像仪中成像。7.LaCD NP在酒精性肝损伤小鼠模型中的成像通过C57BL/6雄性小鼠口服灌胃300μL 50%乙醇构建酒精性肝损伤小鼠模型,为了考察LaCD NP靶向损伤的肝脏,酒精性肝损伤小鼠尾静脉给予Cy7.5/LaCD NP,正常小鼠注射PBS作为对照,10 min后取出肝脏,于IVIS成像仪中成像。为了考察LaCD NP的体内成像能力,酒精性肝损伤小鼠尾静脉给予LaCD NP,正常小鼠注射PBS作为对照,5 min后将小鼠置于IVIS成像仪中成像。之后,立即取出肝脏,进行离体成像。同样的,在酒精灌胃后不同时间,小鼠尾静脉给予LaCD NP,5 min后将小鼠置于IVIS成像仪中成像。8.LaCD NP在急性肝衰竭小鼠模型中的成像通过C57BL/6雄性小鼠腹腔注射100μL 25%CCl₄构建急性肝衰竭小鼠模型,为了考察LaCD NP靶向损伤的肝脏,急性肝衰竭小鼠尾静脉给予Cy7.5/LaCD NP,正常小鼠注射PBS作为对照,10 min后取出肝脏,于IVIS成像仪中成像。为了考察LaCD NP的体内成像能力,急性肝衰竭小鼠尾静脉给予LaCD NP,正常小鼠注射PBS作为对照,5 min后将小鼠置于IVIS成像仪中成像。之后,立即取出肝脏,进行离体成像。同样的,在CCl₄刺激后不同时间,小鼠尾静脉给予LaCD NP,5 min后将小鼠置于IVIS成像仪中成像。9.LaCD NP在急性肝损伤小鼠模型中的治疗C57BL/6雄性小鼠口服灌胃50%乙醇1 h后尾静脉给予不同剂量LaCD NP,11 h后处死小鼠并制备样本,检测血清的肝功能及肝脏组织的中性粒细胞数,MPO和H₂O₂水平以及炎性因子TNF-α和IL-1β水平。同样的,C57BL/6雄性小鼠腹腔注射25%CCl₄ 1 h后尾静脉给予不同剂量LaCD NP,23 h后处死小鼠并制备样本,检测血清的肝功能及肝脏组织的中性粒细胞数,MPO和H₂O₂水平以及炎性因子TNF-α和IL-1β水平。10.LaCD NP在急性肝损伤小鼠治疗中的机制初步探讨不同浓度LaCD NP与H₂O₂和NaClO孵育48 h后测定ROS消耗量;LaCD NP与巨噬细胞和中性粒细胞孵育后,Transwell实验分析细胞迁移能力的变化。在LPS刺激下,不同浓度LaCD NP与巨噬细胞共孵育1 h后,检测细胞炎性因子TNF-α,IL-1β,MCP-1和IL-6水平。同样的,在PMA刺激下,不同浓度LaCD NP与中性粒细胞共孵育1 h后,检测细胞炎性因子MPO,IL-8,TNF-α,IL-1β,MCP-1和IL-6水平。11.LaCD NP的生物安全性评价不同浓度的LaCD NP与RAW264.7巨噬细胞、人脐静脉内皮细胞和HepG2人肝癌细胞共孵育12 h后,MTT检测细胞活性。SD大鼠静脉取血制备红细胞液,与不同浓度的LaCD NP孵育2 h后,考察其溶血行为。Balb/c雌性小鼠尾静脉分别注射500 mg/kg和1000 mg/kg的LaCD NP,15天后,计算脏器指数,检测血常规、肝肾功水平变化,各主要脏器进行H&E染色。结果1.基于鲁米诺/环糊精合成的LaCD中,每个α-CD骨架上连接了大约3个咪唑基团和1个鲁米诺单元;根据纳米沉淀法制备的不同LaCD NP均呈形态规则、大小均一的球形,表面带负电荷;LaCD NP在去离子水或血清中具有较好的稳定性,在高ROS或碱性环境下水解为α-CD及水溶性小分子。2.体外光谱学实验、体外发光实验以及体外孔板成像实验均显示了LaCD NP优良的体外发光性能,其发光强度高,持续时间长,MPO及ClO^-可明显增加其发光强度,而4-ABAH和Tempol均可有效抑制LaCD NP的体外发光。3.提取的腹腔中性粒细胞呈马蹄状的多形核结构,纯度大约为90%;腹腔中性粒细胞能有效吞噬LaCD NP,经PMA刺激活化后,其MPO及ROS水平明显升高,LaCD NP显示出明显的中性粒细胞内光学信号并持续较长时间,4-ABAH和Tempol也可有效抑制LaCD NP的中性粒细胞成像。4.口服灌胃50%乙醇成功建立了酒精性肝损伤小鼠模型,Cy7.5/LaCD NP在损伤的肝脏产生明显的荧光,尾静脉注射LaCD NP后,模型小鼠肝脏产生明显的光学信号,在酒精灌胃后12 h,其发光强度最大,肝脏损伤最严重。5.腹腔注射25%CCl₄成功建立了急性肝衰竭小鼠模型,Cy7.5/LaCD NP在损伤的肝脏产生明显的荧光,尾静脉注射LaCD NP后,模型小鼠肝脏产生明显的光学信号,在CCl₄刺激后24 h,其发光强度最大,肝脏损伤最严重。6.在酒精性肝损伤和急性肝衰竭小鼠模型的治疗实验中,LaCD NP表现出了良好的治疗效果。模型小鼠血清的ALT,AST水平降低,肝脏组织的中性粒细胞浸润减少,肝脏组织的MPO,H₂O₂,TNF-α及IL-1β水平降低。7.体外机制初步研究证实了LaCD NP可以清除高水平的ROS,抑制巨噬细胞和中性粒细胞迁移,并明显抑制中性粒细胞MPO,IL-8,TNF-α和IL-1β的分泌。8.在体内外安全性实验中,LaCD NP不会影响细胞活性,且无明显溶血现象,尾静脉注射500 mg/kg和1000 mg/kg的LaCD NP均不会影响小鼠体重、脏器指数和肝肾功等。结论1.基于鲁米诺键合α-环糊精合成了具有MPO生物响应性的两亲性发光材料LaCD,并通过纳米沉淀法成功制备出了形态规则、大小均一的带负电球形发光纳米粒LaCD NP;LaCD NP在正常的生理条件下表现出良好的稳定性,在高ROS炎性环境下,LaCD NP的结构破坏,并水解为α-CD及水溶性小分子,可以经肾脏排出体外。2.LaCD NP表现出优良的体外发光性能,其发光强度高,持续时间长,且具有良好的MPO和ROS响应性。同时,中性粒细胞能有效吞噬LaCD NP且具有较好的时间及剂量依赖性,LaCD NP能有效用于活性中性粒细胞内的成像并可持续较长时间,也且具有良好的MPO及ROS依赖性。3.LaCD NP可以作为一种新型发光探针,通过成像损伤肝脏浸润的中性粒细胞实现酒精性肝损伤和急性肝衰竭的有效精确检测,并可实时监测肝损伤的发生发展。同时,LaCD NP可以有效缓解急性肝损伤的进程,控制肝脏相关疾病的发展,从而实现急性肝损伤的成像和治疗。4.LaCD NP具有较好的生物安全性,对机体不会产生明显的毒副作用。综上所述,本课题基于鲁米诺/环糊精构建的MPO生物响应性发光纳米粒LaCD NP可以作为一种高效的、可降解的、生物相容性强的发光纳米探针,实时动态监测中性粒细胞介导的酒精性肝损伤和急性肝衰竭的发生发展并实现有效治疗,同时,也有望用于其他中性粒细胞相关疾病的成像和治疗。