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研究目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种嗜肝性DNA病毒,全球感染人数高达2.4亿。慢性HBV感染是诱发肝纤维化、肝硬化以及肝癌的重要原因,也因此造成了每年近100万人类的死亡,是一个世界性的公共卫生问题。伴随着预防性乙肝疫苗的广泛使用,HBV感染的发生已经得到了较好的控制。但是,目前临床方案仍然不能实现慢性HBV感染(Chronic Hepatitis B Virus,CHB)的完全治愈。自然杀伤性细胞(Natural Killer Cells,NK)是机体固有免疫系统的重要组成部分,能够在病毒入侵机体时迅速应答并清除病毒感染的细胞。研究报道,慢性HBV能够导致NK细胞的抗病毒功能受损,IFN-y的产生和杀伤能力受到抑制。PEG修饰的 IFNα-2a(pegylated-IFNα-2a)和核酸类似物(nucleos(t)ideanalogues)对 HBeAg-慢性HBV患者的治疗可恢复NK细胞的功能,但是机制尚未得到明确阐述。STAT3作为转录因子,能够通过靶向不同的下游基因调控细胞的增殖、凋亡和分化等。目前关于内源性STAT3对NK细胞功能调节作用的相关研究较少,并且存在争议。Zhu等报道,内源性STAT3能够通过直接调控NKG2D表达正向调节NK细胞功能;然而,也有研究者报道,STAT3缺失小鼠的NK细胞呈现更强的对B16细胞的免疫监视作用。因此,疾病状态是决定内源性STAT3分子对NK细胞调控作用的关键因素。通过本研究,我们发现HBeAg-CHB患者外周血NK细胞的STAT3表达与其功能呈现正相关性,且HBsAg是造成CHB患者NK细胞STAT3表达水平降低和功能损伤的重要原因之一。除此之外,我们还发现STAT3分子的活化可以直接调控活化性受体NKp46和干扰素激活基因(Stimulator of Interferon genes,STING)的转录,从而增强NK细胞的免疫应答和功能。本研究揭示了慢性HBV感染引起NK细胞功能抑制的新分子机制。研究方法:1.CHB血液样品收集于齐鲁医院检验科,不存在其他病毒疾病感染及自身免疫病。2.采用淋巴细胞分离液(Ficoll)密度分离外周血中的PBMC,并进一步采用CD56磁珠分选试剂盒进行原代NK细胞的分选。3.通过相关性分析初步推断了 STAT3分子与NK细胞受体及功能分子的关系,CHB患者外周HBsAg水平分别与NK细胞STAT3分子和STING分子表达的关系,以及NK细胞STING分子与STAT3分子表达的关系。4.通过电转和慢病毒转染的方法分别建立了 STAT3沉默和STAT3过表达的NK-92细胞系,STAT3沉默和STAT3过表达载体同时表达绿色荧光蛋白(GFP)。5.通过流式细胞术检测NK细胞STAT3、p-STAT3、STING、NK细胞受体及功能分子的表达。6.通过Western blot检测NK-92细胞STAT3的磷酸化水平。7.通过流式细胞术检测FITC-HBsAg与NK-92细胞的结合。8.通过q-PCR检测NK细胞的STAT3分子、STING分子、Cyclin dl以及受体和功能分子mRNA水平表达。9.通过MTT法检测NK-92细胞的增殖能力。10.通过ChIP检测STAT3对NKp46和STING分子的调控机制。研究结果:一、HBeAg-CHB患者外周血NK细胞的STAT3低水平伴随着其功能损伤1.HBeAg-CHB患者外周血NK细胞STAT3表达水平显著降低CHB患者外周NK细胞中STAT3分子的表达及活化水平均呈现显著性的降低,且两个主要亚群(CD56blght CD16-,CD56dimCD16+)中STAT3水平的变化趋势一致。2.STAT3与NK细胞功能性分子呈现正相关性STAT3的表达与NK细胞表达的Granzyme B、perforin和IFN-y分子均呈现了显著的正相关性,与CD107a也呈现正相关趋势。由此可见,STAT3的表达与NK细胞功能有着紧密的联系。二、HBsAg抑制NK细胞STAT3的表达和活化1.HBsAg抑制NK细胞的STAT3信号通路外周血NK细胞STAT3的表达水平与患者血清HBsAg的水平呈现了负相关性,并且HBsAg孵育能够显著抑制PBMC中CD3-CD56+NK细胞的STAT3表达,抑制NK-92细胞STAT3的表达和磷酸化水平。因此,HBsAg是CHB感染引起NK细胞STAT3低表达的重要原因之一。2.HBsAg能够结合于NK-92细胞表面大于60%的细胞能够与荧光素HTC标记的HBsAg(HBsAg-FITC)结合,呈现FITC 阳性;而非荧光标记HBsAg预先孵育,则能够显著降低NK-92细胞与HBsAg-FITC的结合。三、STAT3正向调节NK细胞增殖1.STAT3沉默和过表达NK-92细胞的建立通过转染和筛选,获得GFP 阳性NK-92细胞,其中NK-92-shSTAT3较对照细胞STAT3表达呈现显著性降低,而NK-92-STAT3-over细胞的STAT3表达则呈现显著性的上调。2.STAT3分子正向调控NK-92细胞增殖能力STAT3分子的敲低可以显著抑制NK-92细胞的增殖;反之,STAT3过表达促进了 NK-92细胞的增殖。与之对应,STAT3的沉默导致Cyclin D1呈现表达下降,而在STAT3过表达NK-92细胞里呈现表达上升。四、STAT3正向调节NK细胞功能分子STAT3的敲低能够显著抑制杀伤相关分子CD107a、Granzyme B、Perforin和IFN-γ的表达;而过表达则上调NK细胞功能分子,与之类似,STAT3过表达可以显著提高CHB患者外周血原代NK细胞的CD107a表达。同时,STAT3敲低后抑制IL-21对NK-92细胞IFN-y、CD107a和Granzyme B表达的促进作用。五、STAT3调节NK-92细胞表面受体的表达STAT3敲低下调NK-92活化性受体NKp44和NKp46,上调抑制性受体NKG2A;STAT3过表达仅上调NKp46和NKG2D的表达。NKp46的表达水平与STAT3表达水平呈现显著的正相关性,STAT3过表达可以显著促进CHB患者外周NK细胞的NKp46分子的表达,而敲低STAT3则可以显著抑制IL-21对NKp46的上调。六、STAT3作为转录因子直接调控NKp46的转录CHB患者外周血NK细胞NKp46分子mRNA水平呈现显著性降低。敲低STAT3能够显著抑制NKp46分子的mRNA水平;反之,过表达STAT3上调NKp46mRNA水平。p-STAT3的pull-down样品中发现了两个包含NKp46启动子结合位点的DNA片段,并进行了序列鉴定。除此之外,我们还证明了 HBsAg的存在能够抑制p-STAT3对 Binding Site2 的结合。七、CHB感染抑制NK细胞STING分子的表达CHB患者NK细胞的STING分子的表达呈现显著性的降低,且其表达水平与患者HBsAg的水平呈现了负相关性。八、STAT3调节NK细胞STING分子的表达和应答STAT3和STING的表达呈现显著的正相关性;STAT3过表达可以显著上调STING分子的表达;反之,敲低STAT3抑制STING分子的表达;敲低STAT3可以显著抑制STING激动剂cGAMP对NK-92细胞CD107a和Granzyme B的上调作用。九、STAT3作为转录因子直接调控STING的转录CHB患者外周血NK细胞STING分子mRNA水平呈现显著性降低。敲低STAT3能够显著抑制STING分子的mRNA水平;反之,过表达STAT3上调其mRNA水平。我们在p-STAT3的pull-down中发现了两个包含STING启动子结合位点的DNA片段。因此,STAT3可以作为转录因子结合于STING的启动子区调节其转录。结论及意义:1.通过研究发现,HBeAg-的CHB患者中,HBsAg可以直接结合到NK细胞表面,抑制STAT3的表达及活化。2.研究证明,STAT3能够正向调控NK细胞的增殖能力、杀伤能力和分泌抗病毒细胞因子IFN-γ的水平,是正向调控NK细胞抗病毒功能的重要转录因子。3.研究证明,STAT3可作为转录因子直接调节活化性受体NKp46和信号分子STING的转录,从而调节NK细胞的活化和应答。4.本研究阐述了慢性HBV感染导致NK细胞功能损伤的新的分子机制,并为临床治疗HBeAg-CHB提供了新的靶点。