研究背景：急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一种异质性疾病,随着化疗方案的改进,其缓解率不断提高,但难治和复发仍然是阻碍AML治愈的主要难题。白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)是白血病的起源细胞,这一小群细胞能够自我更新和分化,维持着白血病的发展,LSC大部分处于静止期并表达异常的生存信号通路,这使得它们往往逃逸于主要针对快速增殖细胞的传统化疗药物,成为AML难治复发的关键,因此,在联合化疗的基础上增加针对LSC而又对正常造血细胞无损伤的靶向药物才是AML最有效、最根本的治疗策略。双硫仑(disulfiram, DS)是一种在临床使用了60年的抗酗酒药物,安全低毒且价格低廉。近年来研究发现DS具有广谱的抗肿瘤活性,可以诱导多种肿瘤细胞凋亡并抑制其生长。Cu是生物有机体一种必需的微量金属,许多关键的酶和转录因子需要Cu来发挥活性。DS具有转运Cu离子到胞内的能力,添加外源CuCl2可以明显增强DS杀伤肿瘤细胞的能力。关于DS/Cu抗肿瘤作用的分子机制尚不明确,目前认为主要与其作为蛋白酶体抑制剂抑制NF-κB通路相关以及调节氧化应激反应有关。我们研究团队前期也已经证明了DS/Cu能够通过抑制NF-κB、激活ROS诱导急性淋巴细胞白血病Molt4细胞和淋巴瘤Raji细胞凋亡并抑制其增殖,且能逆转急性髓系白血病细胞HL-60耐药细胞株对多柔比星的耐药。但DS/Cu是否具有杀伤LSC的作用及相关的机制仍不明确。核转录因子kB(Nuclear factor-κB, NF-κB)是一种作用广泛的转录因子,是由两种Rel家族蛋白构成的二聚体蛋白质。p65/p50二聚体是NF-κB中最重要的一种,广泛存在于细胞浆中,可调控下游一系列抗凋亡基因的表达,被认为是调控NF-κB活性的关键成分。NF-κB的异常激活跟多种病理现象相关,它的下游靶基因产物也有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡及促进癌基因蛋白表达的作用。多种肿瘤细胞中也观察到NF-κB的异常激活,同时一些传统化疗药物也可以激活NF-κB,使之成为肿瘤耐药的关键因素。近年研究发现,NF-κB在LSC中持续激活而在正常造血干细胞中不激活,因此,靶向NF-κB相关的信号转导不仅能选择性杀伤LSC,还能增强传统化疗药物的敏感性。活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)是体内正常氧代谢的产物,生理剂量的ROS可以被体内的抗氧化物清除,但急剧增高的ROS可以致使脂质、蛋白质和DNA过氧化,致使细胞发生损伤。近年来发现肿瘤细胞中ROS产生较正常细胞明显增多,即处于一种更高的氧化应激状态,这使得肿瘤细胞较正常细胞更易受外界氧化刺激的影响,同时,在持续的氧化刺激下,一些氧化还原敏感的转录因子(如NF-κB, Nrf2, c-jun, HIF-1)被激活,调节下游的抗氧化蛋白的表达增加,维持肿瘤细胞的氧化平衡,这些转录因子又可通过调节下游基因促进肿瘤细胞的增殖、生长、分化,使肿瘤细胞进一步获得存活优势并产生耐药性。ROS对于维持LSC生存也有重要作用,小白菊内酯及其类似物可以通过抑制NF-kB通路、促进ROS蓄积诱导AML和急变期的CML的LSC细胞凋亡,而对正常的细胞无影响：最近有人发现LSC主要存在于ROS低水平(ROS-low)的AML细胞亚群中,并伴有高表达的BCL-2,使用BCL-2抑制剂ABT-263可以减弱氧化磷酸化,诱导ROS堆积,最终杀伤这群ROS-low的细胞,而对正常HSC无明显影响,提示特殊的氧化还原调节机制也是LSC一个良好的治疗靶点。Nrf2(nuclear factor-erythroid2-related factor2)是氧化调节中重要的转录因子,它由ROS诱导激活,而其靶基因产物又可以保护细胞从而不受氧化应激的损伤。在多种肿瘤细胞中存在Nrf2的异常激活,同样也成为引起肿瘤细胞耐药的重要因素,近年来发现,AML细胞核中存在Nrf2的异常激活,从而保护AML细胞免受氧化损伤并产生耐药性。c-jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)家族是是MAPK(丝裂原激活的蛋白激酶)家族中重要的一员。JNK属于酪氨酸蛋白激酶途径,可被不同形式的胞外刺激通过不同的信号通路活化。JNK/c-Jun通路与多种疾病发生机制有关,在AML的发生、发展及耐药中也有重要作用,多种药物可通过活化JNK通路引起白血病细胞的凋亡,而ROS能够通过抑制JNK磷酸酶及使JNK潜在抑制分子失活等途径使JNK得到持续的活化促进肿瘤细胞凋亡。我们前期的研究发现Disulfiram (DS)单药及DS联合Cu离子(DS/Cu)可以通过抑制NF-kB,诱导ROS蓄积而诱导血液系肿瘤细胞株凋亡和逆转耐药,因此本研究拟进一步探讨DS/Cu对LSC的作用及相关的分子机制。研究目的：本课题以CD34+CD38-KG1a细胞做为LSC模型,并结合CD34+CD38-原代AML细胞和正常HSC,探讨DS及DS/Cu在体外对LSC的靶向杀伤作用,并进一步从NF-kB通路、ROS以及JNK、Nrf2通路探讨其潜在的分子机制。研究方法：1、应用流式细胞分选术或磁珠分选术分选出人急性髓系白血病细胞株KGla细胞和原代AML细胞中具有LSC特性的CD34+CD38-亚群以及正常人外周动员血或脐血中CD34+细胞;2、利用MTT法检测浓度分别为0.08、0.16、0.32、0.64、1.25μM的DS及上述浓度的DS/Cu(Cu=l州)对CD34+CD38-KGla细胞的抑制增殖作用及明确DS和DS／Cu对CD34+CD38-KG1a细胞的半数抑制浓度(IC50)；3、Annexin-V/PI双标记流式细胞术检测0.05、0.5、5μM的DS、DS/Cu(Cu=-1μM)以及DS/Cu联合ROS抑制剂NAC (10mM)对CD34+CD38-KG1a细胞的诱导凋亡作用；4、应用甲基纤维素集落形成实验检测浓度分别为0.01、0.1μMDS及DS/Cu (Cu=1μM)对CD34+CD38-KG1a细胞集落形成能力的影响；5、利用DCFA法流式细胞术检测浓度为0.5μM DS及DS/Cu (Cu=1μM)作用6h、12h、18h、24h后CD34+CD38-KG1a细胞中ROS水平的变化；6、利用Western Blot法测1μM Cu、0.5μMDS、0.5μMDS/Cu(Cu=1μM)以及0.5μM DS/Cu联合ROS抑制剂NAC(NAC=10mM)作用CD34+CD38-KGla细胞24h后细胞内NF-κB通路、JNK通路、Nrf2通路相关蛋白表达的变化；7、利用实时荧光定量PCR法检测0.5μM DS及0.5μM DS/Cu (Cu=1μM)处理CD34+CD38-KG1a细胞24h后Nrf2下游通路GSR、NQO1、HO-1基因表达的变化,采用2-△ct法对PCR结果进行计算,分析上述基因的表达量与各种不同处理组的关系；8、利用Annexin-V、CD34-APC、CD38-PE三标记流式细胞术检测0.1、0.5μM的DS和DS/Cu(Cu=1μM)对磁珠分选后的CD34+CD38-原代AML细胞及HSC的诱导凋亡作用；9、应用甲基纤维素集落形成实验检测0.01、0.05、0.1μMDS及DS/Cu对原代AML细胞及HSC集落形成能力的影响；10、采用SPSS13.0软件进行统计学分析,多种处理因素作用比较采用析因方差分析；两组间均数的比较使用独立样本t检验方法；多组间均数比较采用单因素方差分析方法进行统计,在方差分析显著的情况下使用LSD方法(方差齐性)进行多重比较;若方差不齐则采用近似F检验(如Welch方法)代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较；计量资料用x±s表示,检验水准为α=0.05,双侧检验。研究结果：1、DS和DS/Cu对CD34+CD38-KG1a细胞有明显的抑制增殖作用。MTT结果显示24h的DS和DS/Cu的IC5o分别为(0.54±0.18)μM和(0.21±0.028)μM; DS/Cu对CD34+CD38-KG1a细胞的IC50显著低于DS,差异有统计学意义(t=3.107,P=0.036),提示Cu可显著增强DS对CD34+CD38K-G1a细胞的增殖抑制作用；2、DS/Cu对CD34+CD38-KG1a细胞有诱导凋亡的作用。空白对照组和单Cu组的凋亡率分别为(4.75±2.6)%、(5.6±4.0)%,DS和DS/Cu不同浓度组的凋亡率分别为[(7.6±3.44)%、(15.06±4.58)%、(32.6±6.06)%]和[(28.83±6.34)%、(42.33±3.21)%、(58.93±1.53)%]。经过统计分析,1μM单Cu对CD34+CD38-KG1a细胞没有诱导凋亡作用；DS组中,0.05、0.5μM浓度组DS诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡能力与对照组相比无显著性差异,而5μM浓度组可以显著诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡；DS/Cu组中,不同浓度的DS/Cu均可以诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡(F=119.069,P=0.000),且呈剂量依赖性。同一浓度下,DS和DS/Cu诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡比例均显著高于DS组,差异存在统计学差异(t=-5.078,P=0.007；t=-8.44,P=0.001；t=-7.279,P=0.002)。本实验结果表明DS/Cu对CD34+CD38-KG1a细胞均存在显著诱导凋亡作用,DS仅在高浓度情况下才能诱导CD34+CD38-KG1a细胞凋亡,DS/Cu诱导细胞凋亡的作用明显强于DS。3、DS及DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a细胞的集落形成。0.01、0.1μM的DS及DS/Cu (Cu=1μM)的集落形成单位百分比分别为[(97.19±10.19)%、(69.2±19.54)%]和[(48.55±14.36)%、(0.83±0.72)%]。经统计分析,DS或者DS/Cu均能抑制细胞集落形成,且随着浓度增加,CD34+CD38-KG1a的集落形成能力逐渐降低,DS/Cu组降低更加明显,并表现剂量依赖性。同一浓度下DS和DS/Cu处理CD34+CD38-KG1a细胞后对细胞的集落形成能力的影响均存在统计学差异(t=4.777,P=0.009;t=6.066,P=0.004)。DS和DS/Cu均能抑制CD34+CD38-KG1a细胞集落形成能力,但DS/Cu抑制集落形成的作用明显强于DS。4、DS及DS/Cu能下调NF-κB通路蛋白表达。DS单药可明显抑制胞核内P65蛋白的表达,而DS/Cu抑制P65蛋白表达的能力显著强于DS单药；同样,DS单药和DS/Cu均可抑制NF-κB通路下游c-myc、survivin蛋白的表达,而DS/Cu的抑制作用明显强于DS单药；5、DS/Cu可诱导细胞内的ROS水平、抑制Nrf2通路蛋白表达、上调JNK通路蛋白表达。(1) DS/Cu可诱导CD34+CD38-KGla细胞内ROS蓄积。将0.5μM的DS和DS/Cu分别处理CD34+CD38-KGla细胞6h、12h、18h、24h后观察细胞内ROS水平变化。结果示DS和DS/Cu作用不同时间后ROS水平分别为[(3180±127.3)%、(2489±345.8)%、(2538±373.0)%、(2569±224.08)%]和[(3431±33.7)%、(7145±488.51)%、(11227±438.6)%、(5853±857.5)%],经统计分析,随着作用时间延长,DS处理后CD34+CD38-KG1a细胞的ROS水平较对照组变化不明显,而DS/Cu组ROS水平逐渐升高,且在18h达到顶峰,24h后有一定下降；不同时间点DS/Cu组ROS生成水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000),而DS组ROS水平与对照组间除6h组与对照组有差异外(P=0.000),其余时间点与对照组相比无明显差异(P=0.675；P=0.405；P=0.689)。本结果显示DS单药不能显著诱导CD34+CD38-KG1a细胞内ROS蓄积,但在Cu离子联同作用下可以诱导CD34+CD38-KG1a细胞内ROS蓄积,且这种蓄积随着时间变化,并在18h时达到顶峰。(2) DS/Cu可以抑制Nrf2通路。以Western blot方法检测各处理组作用24h后核内Nrf2蛋白的变化,结果示DS单药可以轻度抑制Nrf2表达,而DS/Cu抑制作用更明显；实时荧光定量PCR方法分别检测细胞内Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1, GSR的表达水平,结果示DS/Cu均可以显著抑制HO-1、NQO1、GSR基因mRNA的表达水平,与对照组相比均有统计学差异(P=0.000；P=0.009；P=0.001),DS不能显著抑制NQO1基因的表达水平(P=0.243),但可以显著抑制HO-1及GSR基因的表达水平(P=0.009；P=0.001)。本结果表明DS/Cu可抑制Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1,GSR基因的表达水平,DS单药对Nrf2及其下游通路HO-1、NQO1,GSR基因的表达水平抑制能力显著低于DS/Cu。(3) DS/Cu可以激活JNK通路。同样以Western blot方法检测作用24h后胞内JNK、p-JNK以及p-c-jun蛋白的变化,结果示JNK无明显变化,而DS单药及DS/Cu均能显著增强p-JNK及p-c-jun的表达,其中DS/Cu处理组的作用更明显。(4)ROS是DS/Cu对CD34+CD38-KG1a细胞产生诱导凋亡作用的关键。加入ROS抑制剂NAC后DS/Cu诱导CD34+CD38-KG1a细胞的凋亡率均出现不同程度下降,0.5gM浓度组从(36.42±2.86)%下降(18.23±6.16)%,5gM浓度组从(53.99±9.34)%下降到(32.22±3.73)%。说明加入抗氧化剂NAC后,DS/Cu的诱导凋亡效应削弱了。同样,利用Western blot比较DS/Cu和DS/Cu/NAC作用后细胞内p-JNK及Nrf2的变化,DS/Cu/NAC组的Nrf2蛋白的表达明显弱于DS/Cu组;p-JNK蛋白的表达上调作用也明显弱于DS/Cu组,说明NAC处理可以减弱DS/Cu对p-JNK的激活以及对Nrf2的抑制作用,提示DS/Cu可以通过ROS调控着JNK和Nrf2的表达。6、DS及DS/Cu具有在体外靶向杀伤CD34+CD38"原代AML细胞的作用。(1)DS/Cu能诱导CD34+CD38"原代AML细胞凋亡而对HSC(CD34+CD38-)作用较弱。0.1、0.5μM的DS和DS/Cu (Cu=1μM) DS及DS/Cu对CD34+CD38-原代AML细的凋亡率分别为[(12.50±4.97)%、(17.90±11.89)%]和[(24.83±5.78)%、(62.5±9.82)%],DS及DS/Cu对HSC的凋亡率为[(9.6±3.68)%、(10.4±3.53)%]和[(24.00±6.17)%、(23.77±10.80)%]。经统计分析,不同浓度的DS/Cu均可诱导CD34+CD38-原代AML细胞凋亡(F=42.834,P=0.000),0.5μM浓度组也能诱导HSC凋亡(F=4.293,P=0.070),但DS/Cu对两种细胞的诱导凋亡能力存在显著差异,对LSC的诱导凋亡作用显著强于HSC(F=15.395,P=0.002)。不同浓度的DS对CD34+CD38-原代AML细胞和HSC的诱导凋亡能力均不显著(P>0.05)。本结果显示DS/Cu可以诱导CD34+CD38-原代AML细胞凋亡,但只有在高浓度情况下才会诱导HSC凋亡；DS单药无显著诱导CD34+CD38-原代AML细胞和HSC凋亡的能力。(2)低剂量的DS及DS/Cu均能抑制CD34+原代AML细胞集落形成而不影响HSC集落形成。不同浓度的DS及DS/Cu处理后原代AML细胞的CFU%分别为[(75.13±13.84)%、(60.24±16.41)%、(20.63±12.08)%]和[(74.95±9.51)%、(44.53±13.31)%、(12.08±13.12)%],DS及DS/Cu处理后HSC的CFU%为[(103.05±19.00)%、(93.81±7.78)%、(99.89±16.72)%]和[(96.31±20.60)%、(101.59±13.71)%、(92.10±10.23)%]。经统计分析,不同浓度的DS和DS/Cu均可以抑制原代AML细胞集落形成(F=35.269,P=0.000,F=16.235,P=0.000),而该浓度范围内的DS及DS/Cu对正常外周血单个核细胞的集落形成并不存在影响(F=1.141,P=0.299；F=0.441,P=0.726),说明DS及DS/Cu对两种细胞的集落形成的抑制作用不同,对原代AML细胞的作用显著强于正常细胞(F=54.591,P=0.000；F=5.842,P=0.007)；本结果表明DS及DS/Cu均可抑制原代AML细胞集落形成,而不抑制正常外周血细胞集落形成。结论：1、DS/Cu具有靶向杀伤LSC的能力,DS单药对LSC也具有一定的抑制增殖、诱导凋亡、抑制集落形成作用,但作用显著低于DS/Cu。2、DS/Cu可通过显著提高LSC内ROS的水平、激活JNK通路、抑制Nrf2和NF-kB通路来实现杀伤LSC;3、在DS/Cu靶向杀伤LSC分子机制中,ROS对JNK通路以及Nrf2通路有调控作用。