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狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒引起的一种急性接触性人畜共患病,又称恐水症,俗称疯狗病。狂犬病的临床特征主要表现为:神经兴奋和意识障碍,继而会因为出现局部或全身麻痹而死亡。病理变化主要特征:非化脓性脑炎和神经细胞细胞浆内出现内基小体。狂犬病病毒呈典型的子弹头状或试管状,直径为75 nm,长度为200～300 nm,大小为12 kb左右。该病毒由11928～11932个核苷酸组成,共编码五种不同的结构蛋白,从3’端到5’端依次是:核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白。G蛋白是一种跨膜蛋白,参与构成病毒表面突起,能与宿主细胞表面的受体结合,并诱导机体产生中和抗体的结构蛋白,在狂犬病的致病过程中起着决定性的作用,还参与狂犬病病毒介导细胞融合和抗体结合等免疫机制。为了在体外能得到免疫活性高,高表达、易储存、成本低的G蛋白,本研究将狂犬病病毒G蛋白导入到水稻的胚乳中表达。首先从NCBI中选出狂犬病病毒G基因序列,并按照水稻偏爱密码子优化G基因序列,然后由南京金斯瑞公司合成,以pUC57为载体,将优化后的G基因序列连接到pUC57,构建成pUC57-G重组质粒,通过双酶切MlyⅠ和XhoⅠ将G基因插入到中间载体pMP3上,成功的构建中间载体pMP3-G,然后用EcoRI和HindⅢ双酶切中间载体pMP3-G和植物载体pCAMBIA1300,回收,T4DNA连接酶连接后,导入大肠杆菌,经过酶切和测序鉴定,成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-G,通过电激法,将重组质粒pCAMBIA1300-G转化到根癌农杆菌EHA105中,经过PCR鉴定,重组质粒已成功地转化到农杆菌中。挑选完整、饱满的水稻种子进行消毒,放在诱导培养基上诱导愈伤,重组质粒pCAMBIA1300-G经过农杆菌EHA105侵染的愈伤组织,导入水稻愈伤组织中,27℃暗培养3d,经头孢水洗愈伤,然后放在含头孢和潮霉素筛选培养基上暗培养长出新愈伤、转化到分化培养基上出芽、最后在生根培养基上生根,获得308株植株、取308株植株叶片,通过CTAB法提取叶片基因组DNA,用PCR鉴定有79株为阳性,经过炼苗、种植共获得50株转基因植株。将获得的50株表达植株进行检测,先研磨,其次加入提取液(25 mM Tris pH8.0),室温提取1h,离心后用抗原检测试纸条和Western blotting检测G蛋白。最后挑选出高表达、反应原性好的4个株系的T1代种子,将这4个株系的T1代种子通过人工组织培养的方法进行生根和种植,待其生长稳定后,取每株水稻的叶片,用CTAB法提取叶片的基因组总DNA,以水稻特有单拷贝基因REB4作为内参,通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法筛选纯合子并计算其拷贝数,其结果显示:132植株中筛选纯合植株为35株。纯合植株的拷贝数分别为1,2,3,5,7,11和16。将获得的T2纯合种子进行再次进行表达量和活性检测,最终挑选出7株高表达量植株,通过再次种植,获得纯合子植株。同时筛选不同的缓冲液溶解G蛋白,然后筛选不同的填料富集G蛋白,最终筛选到溶解蛋白的PB缓冲液和富集蛋白阳离子填料,为下一步中间纯化和精细纯化奠定基础。本研究致力于狂犬病病毒G蛋白在水稻中的表达及纯合子植株的筛选,为制备新型狂犬病G蛋白亚单位疫苗奠定基础。