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目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)单独及联合对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMSCs)向神经细胞分化的影响,并进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在h BMSCs向神经细胞分化中的作用。方法:(1)将购自江阴齐氏生物科技有限公司第2代h BMSCs进行传代、纯化,取第4代h BMSCs进行流式细胞仪检测细胞表面骨髓基质标志CD44、CD90和造血细胞标志CD19、CD34。(2)取第4-6代干性维持较好的h BMSCs,以含1%FBS的α-MEM为基础诱导培养基,根据诱导条件不同分为5组:空白对照组(不添加任何物质)、EGF组(添加20 ng/m L EGF)、b FGF组(添加20 ng/m L b FGF)、EGF+b FGF组(添加20 ng/m L EGF及20 ng/m L b FGF)、EGF+b FGF+DKK-1组(添加20 ng/m L EGF、20 ng/m L b FGF及100 ng/m L DKK-1),倒置相差显微镜观察细胞形态变化。(3)连续诱导7 d后,采用RT-PCR检测神经干细胞标志nestin,神经元细胞标志NSE、MAP-2,神经胶质细胞标志GFAP m RNA表达水平,Western blot及免疫荧光检测NSE、GFAP蛋白表达水平。(4)连续诱导7 d后,采用RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路关键组件GSK-3β、β-catenin、cyclin D1 m RNA表达水平,Western blot检测总β-catenin、P-β-catenin、Cytoplasm-β-catenin、Nucleus-β-catenin蛋白表达水平,免疫荧光检测β-catenin蛋白亚细胞分布情况。结果:(1)第4代h BMSCs基本呈单一成纤维细胞样,漩涡状、鱼群样贴壁生长,流式鉴定结果示CD44、CD90表达分别为98.24%、95.89%,而CD19、CD34合计表达仅为1.91%。(2)连续诱导7 d后,b FGF组、EGF+b FGF组及EGF+b FGF+DKK-1组细胞胞体变小,形成双极和复杂多极的细胞体,部分细胞向四周伸出突起,且少数细胞相邻突起间存在网络样连接,呈典型的神经样细胞形态,而空白对照组与EGF组细胞形态无明显改变。(3)神经细胞标志检测结果:RT-PCR检测示:与空白对照组比较,b FGF组nestin、NSE、MAP-2表达升高(P<0.01),EGF+b FGF组nestin、NSE、MAP-2、GFAP表达升高(P<0.01),且EGF+b FGF组nestin、NSE、MAP-2、GFAP表达高于b FGF组和EGF+b FGF+DKK-1组(P<0.01),EGF组除NSE表达轻度升高外(P<0.05),其余变化无明显差异(P>0.05);Western blot检测示:与空白对照组比较,b FGF组和EGF+b FGF组NSE、GFAP表达均升高(P<0.01),且EGF+b FGF组NSE表达高于b FGF组(P<0.01),NSE、GFAP表达高于EGF+b FGF+DKK-1组(P<0.01),EGF组NSE、GFAP表达变化均无明显差异(P>0.05);免疫荧光检测示:与空白对照组比较,b FGF组、EGF+b FGF组NSE、GFAP阳性率均升高(P<0.01),且EGF+b FGF组阳性率高于b FGF组和EGF+b FGF+DKK-1组(P<0.01),EGF组NSE、GFAP表达变化均无明显差异(P>0.05)。(4)Wnt/β-catenin信号通路关键组件检测结果:RT-PCR检测示:与空白对照组比较,b FGF组和EGF+b FGF组GSK-3β表达降低(P<0.05),而β-catenin、cyclin D1表达升高(P<0.01);Western blot检测示:与空白对照组比较,b FGF组和EGF+b FGF组总β-catenin、Cytoplasm-β-catenin、Nucleus-β-catenin表达均升高(P<0.01或P<0.05),而P-β-catenin表达下降(P<0.01);免疫荧光检测示:空白对照组胞核内β-catenin表达强度较弱,而EGF+b FGF组胞核内β-catenin表达强度明显增强;且阻滞剂DKK-1能抑制上述变化。结论:(1)b FGF能够单独诱导h BMSCs向神经元细胞及神经胶质细胞分化,EGF不具有单独诱导作用,但EGF能够增强b FGF的诱导作用。(2)Wnt/β-catenin信号通路在h BMSCs向神经细胞分化过程中发挥正向调控作用。