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第一部分：清活Ⅰ号单体对大鼠胸主动脉环的舒张作用目的川芎嗪、西红花苷、阿魏酸、绿原酸是我导师课题组在前期工作中从具有“清热解毒,活血化瘀”的中药复方清活Ⅰ号中分离的有明显抗氧化应激作用的单体。本研究的目的是在大鼠动脉环的器官水平上评价这4个单体的内皮依赖和非依赖的舒张功能,并找到其中内皮依赖的舒张作用最为明显的单体。方法从SD大鼠中取出胸主动脉后,剪成直径为3-4mm的胸主动脉环。将这些动脉环随机分为内皮完整组和内皮去除组。内皮去除组动脉环的内皮用聚乙烯管去除。将这两组的动脉环置于水浴槽中后,用动脉环对10-5mol/L乙酰胆碱的舒张活性验证内皮的完整性；然后加入苯肾上腺素预收缩血管,采用累积加药法评价川芎嗪、西红花苷、阿魏酸、绿原酸对内皮完整、内皮去除动脉环的最大舒张百分比(Emax)和pIC50。结果川芎嗪在10-6mol/L-10-3mol/L浓度范围之间对主动脉环的舒张作用呈剂量依赖性,对内皮完整动脉环的最大舒张率大于对去内皮血管的舒张百分比(90.36%vs.55.38%,P<0.001)：西红花苷在10-7mol/L-10-4mol/L浓度范围之间呈浓度依赖性的舒张动脉环,对内皮完整动脉环的最大舒张率明显优于对去内皮血管的舒张百分比(41.3%vs.9.6%,P<0.001),但随着西红花苷浓度的继续增加,舒张动脉环的作用不具有浓度依赖性；阿魏酸在10-7mol/L-10-3mol/L浓度范围内呈剂量依赖性的舒张动脉环,但对内皮完整动脉环的最大舒张百分比与去内皮动脉环的舒张百分比相比没有明显差异(59.4%vs.55.4%,P>0.05)；绿原酸在10-7mol/L-10.-4.5mol/L浓度区间内呈剂量依赖性的舒张动脉环,对内皮完整动脉环的舒张作用大于对去内皮血管的舒张作用,但当绿原酸的浓度大于10-4.5mol/L,舒张血管的作用不明显。结论川芎嗪存在内皮依赖和非依赖舒张血管作用,此作用呈浓度依赖性；西红花苷和绿原酸分别在10-7mol/L-10-4mol/L和10-7mol/L-10-4.5mol/L浓度范围内存在内皮依赖的舒张血管作用,它们内皮非依赖的舒张血管作用不明显；阿魏酸仅存在内皮非依赖的舒张血管作用。在器官水平上川芎嗪内皮依赖的舒张血管作用强于西红花苷、阿魏酸、绿原酸等清活Ⅰ号的单体,提示川芎嗪可能是这四个单体中促进NO生成活性最强的药物。目的第一部分的结果提示在动脉环的器官水平上川芎嗪(TMP)、西红花苷、阿魏酸、绿原酸四个单体中川芎嗪内皮依赖的舒张作用最强,推测其促进NO生成的作用最强。此部分的目的是在细胞水平上建立川芎嗪改善高葡萄糖诱导的内皮细胞中NO生成的模型,并在此模型中验证其抗氧化活性。方法从新鲜的人脐静脉中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用免疫荧光鉴定HUVEC表面是否存在CD31抗体。以HUVEC和小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)为模型,将细胞分为对照组(5.6mmol/L)、30mmol/L高葡萄糖组、TMP处理组(30mmol/L高葡萄糖+30gmol/L TMP),其中高葡萄糖的处理时间为48h,TMP的处理方式是预先孵育24h。处理结束后用DAF-FM探针检测各组细胞NO的水平,并用CM-H2DCFDA探针检测各组细胞中ROS水平的变化。结果免疫荧光的结果表明从人脐静脉中分离的细胞表面存在CD31抗体,提示此细胞为HUVEC。DAF-FM探针的检测结果发现与对照组相比,高葡萄糖组NO水平降低；但用30μmol/L TMP预孵育bEnd.3和HUVEC细胞24h后,可以增加高葡萄糖诱导的内皮细胞中NO生成；CM-H2DCFDA探针的检测结果显示TMP能减少此细胞中ROS的水平。结论从人脐静脉中分离的细胞为脐静脉内皮细胞。TMP预孵育细胞24h后,能明显改善高葡萄糖诱导的内皮细胞中NO的生成,同时与前期工作中结果一致,TMP可以减少此模型中ROS的水平,提示TMP改善高葡萄糖诱导的内皮细胞功能受损的模型建立是成功的,并且TMP改善内皮细胞功能受损的机制与其抗氧化应激作用相关。目的在第二部分中我们用bEnd.3和HUVEC细胞建立了川芎嗪(TMP)改善高葡萄糖诱导的内皮损伤模型。此部分的目的是首先在此模型中探讨川芎嗪的抗氧化应激作用是否是通过改善线粒体功能发挥的；其次进一步探讨TMP改善线粒体功能的分子机制。方法类似于第二部分,bEnd.3和HUVEC细胞分为对照组(5.6mmol/L)、30mmol/L高葡萄糖组、TMP处理组(30mmol/L高葡萄糖+30μmol/L TMP),其中高葡萄糖的处理时间为48h,TMP的处理方式是预先孵育24h。用MitoSOXTMRed探针检测处理结束后TMP对细胞线粒体内超氧阴离子水平的影响。TMP对细胞内线粒体功能影响用线粒体膜电位和呼吸链复合体Ⅲ的表达评价,分别用JC-1探针和免疫印迹方法检测。最后用实时定量PCR和免疫印迹方法在mRNA和蛋白表达水平检测TMP对细胞内SIRT1表达的影响以及加入SIRT1活性阻断剂EK-527前后TMP对PCG-1α及其下游基因表达的影响。结果与高葡萄糖组相比,30μmol/L TMP预孵育处理后能降低高葡萄糖诱导的内皮细胞线粒体中的超氧阴离子水平,同时逆转高葡萄糖诱导的内皮细胞线粒体膜电位的降低、增加呼吸链复合体Ⅲ的表达。TMP能上调高葡萄糖培养的bEnd.3和HUVEC细胞中SIRT1、PCG-1α以及PCG-1α下游信号通路的mRNA和蛋白表达；加入SIRT1的抑制剂EK-527后,TMP上调PCG-1αmRNA表达的作用明显降低。结论TMP可以改善高葡萄糖诱导的内皮细胞线粒体功能受损和线粒体内氧化应激状态。TMP发挥此作用的机制与其靶向作用于SIRT1,促进PCG-1α及其下游的信号分子表达,从而促进线粒体生物合成相关。提示SIRT1可能是川芎嗪改善高葡萄糖诱导的内皮细胞功能受损的作用靶点。