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【目的】探讨miR-224(MircoRNA-224,miR-224)对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)脂质蓄积的影响及分子机制。【方法】(1)利用GEO数据库中基因芯片数据对小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)斑块中的miRNA表达情况进行生物信息学分析;采用qRT-PCR检测miR-224在oxLDL处理人VSMCs中的表达情况。(2)将miR-224 mimics转染人VSMCs,再分别加入Dil-oxLDL(20μg/ml)孵育4小时或oxLDL(50μg/ml)处理24小时,采用荧光显微镜观察细胞对Dil-oxLDL的摄取、油红O染色观察细胞内脂滴以及总胆固醇(Total cholesterol,TC)检测试剂盒分析细胞内TC含量,以观察miR-224对VSMCs脂质蓄积的影响。(3)miR-224 mimics转染VSMCs后不加或加oxLDL处理,运用qRT-PCR、Western blot检测VSMCs上清道夫受体LOX-1表达的情况,利用生物信息学方法分析miR-224与LOX-1 3’UTR结合的可能性。(4)利用生物信息学方法筛选miR-224候选靶基因并进行功能富集分析;采用RNA干扰技术敲低VSMCs中miR-224候选靶基因PCSK9表达,在此基础上利用Western blot检测VSMCs中LOX-1表达变化;利用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因系统对miR-224与PCSK9 3’UTR的靶向结合作用及结合位点进行分析。(5)用不同浓度miR-224 mimics处理VSMCs不同时间,或VSMCs转染miR-224 mimics后再加入oxLDL处理,qRT-PCR和Western blot检测VSMCs中PCSK9表达水平。(6)将LV-PCSK9和miR-224 mimics共同转染VSMCs,再加Dil-oxLDL或oxLDL处理,采用qRT-PCR、Western blot检测细胞中LOX-1的表达变化;荧光显微镜观察、油红O染色、TC检测试剂盒分析VSMCs脂质蓄积情况,以评价PCSK9过表达是否改变miR-224对VSMCs脂质蓄积的调节作用。【结果】(1)基因芯片分析结果显示,与正常主动脉组织相比,miR-224在小鼠As斑块中表达增高;qRT-PCR检测结果显示,oxLDL处理VSMCs组miR-224表达水平比未处理组明显升高。(2)与Dil-oxLDL单独处理组相比,miR-224+Dil-oxLDL组VSMCs对Dil-oxLDL的摄取减少;油红O染色和TC检测试剂盒分析结果显示,miR-224+oxLDL组与oxLDL单独处理组相比,VSMCs中红染脂滴明显减少、TC含量降低。(3)qRT-PCR和Western blot结果显示,miR-224可以下调VSMCs中LOX-1 mRNA和蛋白质基础表达水平,也可以抑制oxLDL诱导的VSMCs中LOX-1表达上调;生物信息学分析结果显示miR-224与LOX-1 3’UTR之间并不存在靶向结合。(4)生物信息学分析结果显示PCSK9是miR-224候选靶基因之一;Western blot结果显示,PCSK9siRNA下调VSMC中LOX-1蛋白质表达水平;双荧光素酶报告基因结果显示miR-224可与PCSK9 3’UTR上322-327处的结合位点靶向结合。(5)qRT-PCR和Western blot结果显示,miR-224呈浓度和时间依赖性下调VSMCs中PCSK9 mRNA和蛋白质的表达,并抑制oxLDL引起的VSMCs中PCSK9表达上调。(6)qRT-PCR和Western blot结果显示,LV-PCSK9逆转了miR-224对VSMCs中LOX-1表达下调的抑制作用;荧光显微镜观察、油红O染色以及TC检测试剂盒分析结果显示,LV-PCSK9减弱了miR-224对VSMCs脂质蓄积的抑制作用。【结论】miR-224通过与PCSK9 3’UTR上322-327处的结合位点靶向结合,沉默其表达,从而导致VSMC中LOX-1表达减少,抑制VSMCs脂质蓄积。