目的:多发性硬化（multiple sclerosis ,MS）是一种常见的中枢神经系统（central nervous system,CNS）脱髓鞘疾病。长期以来一直认为MS是以CNS广泛的髓鞘脱失而轴索结构相对保存为特征的原发性脱髓鞘病变。直到上世纪九十年代末期国外学者证实在MS急性和慢性病灶中均存在轴索损伤,受损轴索多存在于硬化斑内或其边缘,在大体形态正常的白质中也有少量的轴索破坏。病灶中的轴索损害引起wanerina变性,导致轴索缺失。目前认为轴索变性或损害是MS主要病理改变之一,在病程早期就开始发生,而且可能是导致临床上出现进行性神经功能障碍的主要因素。轴索损伤的程度与病情的严重程度相关。因此,目前对于多发性硬化轴索损伤机制以及相关的轴索损伤保护作用的探索正成为研究的热点。轴索损害的原因和确切机制目前仍不清楚。目前一些国内外研究表明:氧化应激在MS的发病中起了非常重要的作用。氧化应激反应产生的氧自由基及其他代谢产物可氧化体内的生物大分子,诱发自由基链式反应,产生大量脂质过氧化产物,造成生物膜损伤,各种亚细胞器结构破坏,酶活性降低或消失,引起细胞自溶。α-硫辛酸作为一种强的抗氧化剂,已引起人们的广泛重视。它属于维生素B类化合物,是一种天然抗氧化剂。它主要通过清除自由基,螯合金属离子,再生其他抗氧化剂而来发挥其抗氧化作用。在国外,它通过干预氧化应激过程,减少自由基对血管和神经的损伤作用而被用于治疗糖尿病周围神经病变并且已取得了较好的疗效。但目前国内外对α-硫辛酸及于多发性硬化的研究很少,关于α-硫辛酸对MS轴索损伤是否具有保护作用,尚不清楚。本实验通过建立多发性硬化模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）,检测大鼠发病过程中轴索损伤相关指标,了解MS发病过程中轴索损伤情况。通过α-硫辛酸对EAE大鼠的干预来观察轴索损伤指标的相应变化,了解对轴索损伤的保护作用,从而为临床治疗MS提供新的思路和实验依据。方法:1动物分组:将80只成年健康雌性Wistar大鼠,体重180～200 g,随机分出正常对照组（NC组）6只,其余用新鲜豚鼠全脊髓匀浆（GPSCH）诱导免疫,待第一次发病后随机选出发病组（DIS组）大鼠6只,其余平均分为EAE组、硫辛酸组(LA组,100mg·kg^-1·d^-1)和地塞米松组(DXM组,2mg·kg^-1·d^-1)。其中EAE和各药物干预组再按病程分为缓解组（REM组）、复发组（REL组）两个亚组,每亚组6只,药物干预组动物无复发者,按预实验中统计的EAE组动物缓解复发平均天数分为干预后7天组（LA7d组;DXM7d组）和干预后14天组（LA14d组;DXM14d组）。2模型制备:将新鲜豚鼠全脊髓制成匀浆,加上等量完全福氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）制成完全免疫抗原。0.5 ml/只,分别于大鼠四肢足垫和背部皮下注射。药物治疗组于动物发病后第一天起给予相应剂量腹腔注射,连续注射7天。3神经功能评分:于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用国际通用的Kono评分标准,分为5分:1分动物尾部无力;2分尾部无力+肢体无力;3分肢体轻度麻痹;4分肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分濒死状态或死亡。4组织病理学:在动物麻醉状态下,快速取其脊髓腰膨大组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片。行改良的三色染色和改良Bielschowsky银染色,光学显微镜下观察病理学改变。5免疫组织化学染色:取动物脊髓腰膨大处组织,石蜡包埋,做6μm横截面切片,血清封闭,分别加神经丝蛋白（NF,Neurofilament protein）和β-淀粉样前体蛋白（β-APP,β-amyloid precursor protein）的一抗,经二抗、三抗孵育,DAB显色,苏木精复染,脱水透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察NF和β-APP的表达情况。6β-APP的免疫印迹（Western Blot）:动物麻醉状态下,迅速取脊髓腰膨大处组织置于-80℃冰箱内备用。提取蛋白,电泳,转膜,封闭,加一抗,洗膜,加二抗,洗膜,显色。图像采集,数据分析。结果:1动物复发情况观察:EAE组动物复发率58.3%, LA组动物复发率8.3%,DXM组动物无复发。LA组、DXM组复发率均小于EAE组,有统计学意义（P<0.05）。LA组与DXM组之间无统计学意义（P>0.05）。2动物行为学观察:在动物缓解期（发病后第7天）和复发期（发病后第14天）时神经功能评分比较:（1）缓解期:LA组、DXM组评分均小于EAE组,有统计学意义（P<0.05）,LA组与DXM组之间评分比较无统计学意义（P>0.05）;（2）复发期:LA组、DXM组评分均小于EAE组,有统计学意义（P<0.05）,LA组、DXM组之间评分比较无统计学意义（P>0.05）。3组织病理学观察:3.1改良三色染色:结果显示:正常对照组轴索绝大多数粗细均匀,走行方向较一致,轴索的连续性完好。余各组均不同程度出现轴索改变,可见轴突肿胀、增粗、弯曲,着色不均,呈锯齿状或串珠状,不连续,甚至断裂。髓鞘结构层次紊乱,疏松,崩解;3.2改良Bielschowsky银染色:结果显示:正常对照组轴索绝大多数粗细均匀,走行方向较一致,轴索的连续性完好。余各组均不同程度出现轴索改变,包括轴索肿胀、粗细不均、畸形,部分出现空泡状淡染,有的甚至出现断裂,部分形成收缩球。4免疫组织化学染色:4.1脊髓组织中NF表达:结果显示:正常组NF表达量最多;与正常组相比,发病期NF表达量减少,缓解期表达量有所增加,复发期表达量再次减少,差异均有显著性,p<0.05;经LA和DXM药物干预后NF表达量有所增加,差异有显著性,p<0.05。4.2脊髓组织中β-APP表达:结果显示:正常组β-APP有所表达,但量很少;与正常组相比,发病期β-APP表达量增多,缓解期表达量有所减少,复发期表达量再次增多,差异均有显著性,p<0.05;经LA和DXM药物干预后β-APP表达量有所下降,差异有显著性,p<0.05。5脊髓组织中β-APP的免疫印迹结果:正常组β-APP有所表达,但量很少;与正常组相比,发病期β-APP表达量增多,缓解期表达量有所减少,复发期表达量再次增多,差异均有显著性,p<0.05;经LA和DXM药物干预后β-APP表达量有所下降,差异有显著性,p<0.05。结果与β-APP的免疫组织化学的结果相一致。结论:1硫辛酸可以促进EAE大鼠的病情缓解,降低动物复发率。2通过改良三色染色和改良的Bielschowsky银染色法,均可见在EAE大鼠中存在轴索损伤的病理改变。3 EAE大鼠脊髓组织中β-APP和NF的表达均与病情活动性相关,随病程发展呈一定的变化趋势,药物干预对各指标有一定影响。4硫辛酸对EAE大鼠轴索损伤有一定保护作用。