【摘 要】
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两性霉素B是一种多烯大环内酯类抗真菌药,广泛用于重症和致命性全身真菌感染的一线治疗。两性霉素B通过靶向结合或者隔离真菌细胞膜上的麦角固醇,诱导细胞氧化应激杀死真菌。真菌可通过麦角固醇含量降低、形成生物膜等方式对两性霉素B耐药。对两性霉素B耐药性与基因组结构变异的关联研究较少,本研究以酿酒酵母为研究对象,构建人工基因组重排体系,挖掘细胞耐药表型与结构变异的关联,解析两性霉素B耐药新机制。本研究设计构
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两性霉素B是一种多烯大环内酯类抗真菌药,广泛用于重症和致命性全身真菌感染的一线治疗。两性霉素B通过靶向结合或者隔离真菌细胞膜上的麦角固醇,诱导细胞氧化应激杀死真菌。真菌可通过麦角固醇含量降低、形成生物膜等方式对两性霉素B耐药。对两性霉素B耐药性与基因组结构变异的关联研究较少,本研究以酿酒酵母为研究对象,构建人工基因组重排体系,挖掘细胞耐药表型与结构变异的关联,解析两性霉素B耐药新机制。本研究设计构建了含有两条环形合成型染色体的酿酒酵母底盘细胞,人工诱导基因组重排构建两性霉素B耐药性菌株文库。经连续传代筛选,获得10株两性霉素B耐药性状稳定的菌株进行表型验证和基因型测定。针对全基因组测序数据开展比较基因组分析,发现了 V号和X号染色体在两性霉素B条件下结构变异的基因组重排热点事件,包括YEL011W-loxPsym-YJL112W、YER021W、YER022W、YER023W、YER024W-loxPsym-YJL112 W。分析染色体拷贝数变异,发现2株耐药性菌株X号染色体的674256 bp-697357 bp区域拷贝数减少,包括基因YJR148W-YJR155W,10株耐药性菌株X号染色体的92130 bp-145125bp区域拷贝数,包括基因YJL1 70C-YJL139C。基于比较基因组分析的结果对基因拷贝数变异的功能进行检测。X号染色体的674256 bp-697357 bp区域通过酿酒酵母同源重组删除,该区域（YJR148W-YJR155W）的删除与酿酒酵母两性霉素B的耐受性提升没有关联。通过酿酒酵母组装构建YJL1 70C-YJL156C和YJL155C-YJL139C基因片段,在天然酵母菌株BY4741中转化点板验证,发现YJL155C-YJL139C的拷贝数增加导致酿酒酵母两性霉素B耐受性的提升。进一步分析确认了基因YJL150W和YJL149W的额外拷贝提升了酿酒酵母两性霉素B耐受性,使菌株在0.75mg/L两性霉素B条件下的倍增时间分别降低了 21.9%和23.5%,并初步分析了YJL150W和YJL149W的额外拷贝提升酵母对两性霉素B的耐受机制。本研究通过基因组重排揭示了酿酒酵母X号染色体YJL155C-YJL139C的拷贝数增加和单基因YJL150W和YJL149W的拷贝数增加对两性霉素B耐药性的影响,丰富了对酿酒酵母两性霉素B产生耐药性的认知,为解读酵母基因结构与耐药性提供了新的思路,对于剖析真菌基因变异与耐药表型的关系具有深远意义。
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