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一研究背景与目的：胰腺癌（pancreatic cancer）是一种临床表现隐匿，进展迅速和预后极差的消化道恶性肿瘤。手术切除是唯一根治的手段，但是，多数患者就诊时已属晚期，只有10％—20％的患者有手术切除机会；手术切除的病人术后也多发生复发和转移，故此胰腺癌的预后极差，总体5年生存率低于5％，确诊后平均生存时间不超过6个月。化疗是胰腺癌重要的辅助治疗手段，对于改善生存质量，延长生存期有一定作用。目前，吉西他宾是胰腺癌化疗的一线药物，但总体有效率低于20％。蛋白酶体是一庞大的、多价复合酶，对于真核细胞处理废弃和损伤的蛋白质极为重要，负责大部分细胞内非溶酶体性蛋白质的降解。通过蛋白质的泛素化和降解，蛋白酶体调控细胞许多重要的功能，如细胞周期，基因转录和凋亡，因此成为肿瘤治疗的靶点。bortezomib是一种特异性较强的蛋白酶体抑制剂，目前作为具有良好前景的抗癌药物在研究中。注射用bortezomib（Velcade）已被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。目前，对bortezomib在胰腺癌中的治疗作用也有一些研究，然而均不深入，其具体作用机制仍不确切。因此，了解bortezomib的药效机制，有助于我们在未来更加合理有效地应用其治疗胰腺癌。我们通过一系列实验探讨了bortezomib对胰腺癌细胞株生物学行为的作用，采用Affymetrix公司的HG U133A 2.0芯片检测两个胰腺癌细胞株在bortezomib应用前后基因表达谱的变化，从而分析bortezomib的作用机制及其增强吉西他宾药效的机理。二材料和方法1．采用台盼蓝排斥试验法检测不同浓度梯度bortezomib（1nM、10nM、100nM、1μM、10μM）对细胞活力的影响，初步确定下一步实验浓度。MTT方法检测bortezomib（20、40、80、160nM）、吉西他宾单独应用及40nmol/L bortezomib与不同浓度吉西他宾联合应用时对细胞生长的抑制。选择合适的浓度及作用时间点进行后续实验。2．对数期生长的BxPC-3细胞每只0.1ml（5×106）接种于4-6周龄雌性BALB/Cnu/nu裸小鼠背部皮下，制成胰腺癌种植瘤模型，待肿瘤全部长出后随机分为4组，分别给予生理盐水，bortezomib（1.0mg/kg），吉西他宾（125mg/kg），及bortezomib（1.0mg/kg）联合吉西他宾（125mg/kg）每周一次腹腔注射，连续4周，研究bortezomib在体内的抗胰腺癌作用。3．分别采用缺口末端标记法（TUNEL）、流式细胞术和透射电镜检测bortezomib在体外诱导的胰腺癌细胞凋亡。4．采用Affymetrix公司的HG U133A 2.0寡核苷酸基因芯片，检测两种细胞株接受bortezomib处理前后的基因表达谱的变化，DAVID分析基因功能，进而探讨bortezomib的作用机制。5．荧光定量RT-PCR方法（相对定量）对选择的芯片结果中差异表达的5个感兴趣的基因进一步验证。6．统计分析。数据表达为均值±标准误，进行双侧t检验或单因素方差分析（LSD多重比较），P＜0.05视为具有统计学意义。统计由SPSS 11.5统计包完成。三结果1．Bortezomib在体外对胰腺癌细胞生长的抑制MTT方法检测不同浓度的bortezomib作用于胰腺癌细胞24h，48h，72h和96h的效应。80nM bortezomib在两细胞作用24h均引起中等程度的抑制（BxPC-3和PANC-1的抑制率分别为35.5％和33％），48h起则明显抑制（BxPC-3和PANC-1的抑制率分别为48.5％和54％），而160nM 48h起几乎全部抑制BxPC-3，72h起几乎全部抑制PANC-1。吉西他宾则对两细胞显示不同的敏感性，0.05μg/ml吉西他宾作用48h和72h后，引起48.33％和76％BxPC-3细胞死亡，而50μg/ml的吉西他宾才能引起相似的结果（45.67％和67％）。Bortezomib在体外显示可增强吉西他宾的效果。0.05-50μg/ml吉西他宾单独或联合40nmol/L bortezomib作用于PANC-1，48h后显示50μg/ml的吉西他宾联合bortezomib处理时抑制率显著高于单独作用（P＜0.05）。而应用低浓度吉西他宾（0.05μg/ml-5μg/ml）时，无统计学差异。BxPC-3细胞具相似的结果，0.05μg/ml-5μg/ml吉西他宾联合bortezomib处理48h，与单独作用相比显示显著增高的抑制率（P＜0.05）。而应用低浓度的吉西他宾（0.005μg/ml）时，无统计学差异。2．Bortezomib在体内对胰腺癌种植瘤生长的抑制Bortezomib组和吉西他宾组与对照组相比，均显著减少肿瘤体积，两组间无统计学差异，联合治疗组的肿瘤体积显著小于Bortezomib组和吉西他宾组（P＜0.05），而所有裸鼠无死亡，各组间的体重在治疗期间无显著差异，显示良好的耐受性。3．Bortezomib在体外诱导胰腺癌细胞凋亡流式细胞术：BxPC-3和PANC-1细胞接受Bortezomib、吉西他宾和联合处理24到48h，细胞周期分析显示经过24和48h后，联合治疗均引起sub-G0期细胞数目的显著增多，提示bortezomib显著增加吉西他宾的诱导凋亡。电镜观察：对照组BxPC-3细胞生长旺盛，细胞质中细胞器丰富，代谢活跃，染色质絮状弥散分布，细胞核分裂相多。Bortezomib组细胞24h出现早期凋亡，可见核浓缩，核边际化等各种细胞凋亡的表现，48小时此现象更加明显。类似的结果同样见于PANC-1细胞。缺口末端标记法（TUNEL）：BxPC-3细胞接受bortezomib（100nM）、吉西他宾（0.05μg/ml）和联合处理24h。观察计算凋亡率，bortezomib组（5.962±0.426％）和吉西他宾组（7.298±0.550％）显著高于对照组（0.490±0.010％）（P＜0.001），联合组（29.426±1.223％）显著高于各单独作用组（P＜0.001），单独作用组间无统计学差异（P=0.198）。4．Bortezomib诱导之胰腺癌细胞表达谱变化采用HG U133A 2.0寡核苷酸基因芯片检测两细胞株接受PBS（对照）及bortezomib（100nM）处理24h。在处理组和对照组比较中发现，Bortezomib诱导两种细胞3倍以上表达的共同基因44个（属于多种具有促进和抑制凋亡的不同功能的基因），抑制5倍以上的共同基因24个。GO分析44个基因，多数与未折叠蛋白反应（9 genes），细胞蛋白代谢（20 genes）和凋亡（8 genes）有关。Bcl-2基因被bortezomib不同程度地抑制（PANC-1，2倍；BxPC-3，3.73倍），其它Bcl-2家族基因如Bax，Bak1，Bad，Bik和Bcl211（Bcl-xl）等未见明显变化。对于NF-kB家族，两株细胞中其所有5个成员NFKB1（p105），NFKB2（p100/p49），RelA（p65），RelB和Rel均未被bortezomib引起变化。其它与凋亡或药物代谢有关的基因如TP53，ABCB1（mdr1）均无一致性的变化。5．qRT-PCR验证基因芯片结果验证了5个和凋亡有关的基因（GADD45B，DDIT3，PPP1R15A，HSPA1B，HSPB1），两种方法所得基因表达倍数大致相当。四结论1 Bortezomib在体内外有不同程度的抗胰腺癌作用，并能增强吉西他宾的效果。2 Bortezomib在体外对胰腺癌细胞有显著的诱导凋亡，并能增强吉西他宾的效果。3 Bortezomib能诱导胰腺癌细胞多种具有不同的促进和抑制凋亡的基因表达上调，这些基因协调作用，决定细胞的凋亡与否。