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类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)是由VPGXG五肽重复序列构成的人工合成蛋白分子,具有温度诱导的可逆相变特性,即随温度的改变从可溶(不溶)状态转变为不溶(可溶)状态。内含肽(Intein)是蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列,其解离及两侧氨基酸序列的连接在自身催化作用下完成,因此具有自主剪切特性。以ELP—Intein融合序列构建的表达载体,表达产物不仅可利用ELP的温度诱导可逆相变特性,用离心法进行纯化,而且可利用Intein自主剪切能力,使目的产物能自动释放。因此,ELP—Intein介导的表达系统不仅能解决表达产物的可溶性等问题,而且能大大简化分离纯化与裂解释放等难题,对重组酶和抗菌肽的表达与纯化具有十分独特的优势。抗菌肽( Antimicrobial polypeptides,AMPs)是两性带电分子,广泛存在于多种生物体内,具有广谱抗菌、抗病毒、抑制肿瘤等多种生物学活性和广泛的应用前景。其中,CA-MA是由天蚕素A (Cecropin A,CA)1～8个氨基酸与蛙皮素Ⅱ(Magainin,MA)1～12个氨基酸的杂合抗菌肽,它既保持了CA和MA的抗微生物活性,又具有抗肿瘤活性,而且不具有溶血性等细胞毒性,已在酵母和普通原核系统获得成功表达,但其分离纯化过程复杂,生产成本较高。为了构建简单、经济的抗菌肽表达系统,用限制酶消化法去除含ELP和ΔI-CM intein编码序列载体pET-EIGFP中的GPF报告基因,获得ELP-Intein介导的原核表达载体pET-EI;以pTYB11为模板,用PCR扩增出Sce VMA intein编码序列,用其取代pET-EI中的intein序列,获得表达载体pET-ESI;以pTWIN1为模板,用PCR扩增其中的Mxe intein编码序列,克隆在去除ΔI-CMintein编码序列的pET-EI载体中的ELP编码序列上游,获得表达载体pET-MIE;根据CA-MA序列设计寡核苷酸并引入适当的酶切位点,通过重叠PCR扩增出CA-MA编码序列,将其分别插入表达载体pET-EI、pET-ESI和pET-MIE中,获得重组表达载体pET-EICA-MA、pET-ESICA-MA、pET-MIECA-MA。此三种重组表达载体的重组菌分别进行梯度低温诱导表达,然后在不同温度下反复离心,获得融合蛋白前体ELP-Intein-CA-MA,并经不同温度、(NH4)SO4反复沉淀和裂解获得纯化蛋白。试验结果显示,在三种重组载体的转化菌中,从pET-EICA-MA转化菌中可表达和纯化出重组抗菌肽CA-MA;经Tricine-SDS-PAGE检测证明,纯化CA-MA的分子量为预期的3kDa;以DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,用琼脂扩散法和微量肉汤稀释法进行溶菌活性和最小抑菌浓度检测,结果显示纯CA-MA具有抑菌活性,最小抑菌浓度分别为14.5μg/mL和9.2μg/mL。