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脑缺血后的组织损伤大部分为细胞坏死,主要表现为细胞器水肿、ATP含量下降、活性氧增多、细胞内Ca2+升高以及细胞器和细胞膜最终破裂。过去认为坏死是不可逆的,不可调控的,因此,相对于凋亡而言,坏死的研究较少。然而,最近研究发现了一种受到精密调控的“新型”细胞死亡方式,即:程序性细胞坏死(Necroptosis)。目前研究认为,Necroptosis是由Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族成员或肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)的激活而启动,在胞内由两个受体相互作用蛋白激酶(Receptor interacting protein kinase,RIPK),即:RIPK 1和RIPK 3传递死亡信号,募集并磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)而形成坏死小体,最终导致细胞死亡。脑缺血损伤后坏死细胞失去胞膜完整性,细胞内容物释放损伤关联分子模式(Damageassociated molecular patterns,DAMPs),能引发剧烈的炎症反应。而凋亡和自噬一般不引起或仅有轻微的炎症反应。深入研究Necroptosis的分子机制及其与炎症反应之间的关系已成为目前国际细胞死亡领域一个新的热点和趋势。脑缺血后损伤区细胞坏死的机制,以及随着缺血时间的延长,坏死细胞的类型和动态变化规律等问题,目前尚未见有明确报道。脑缺血后由于血脑屏障损害,单核/巨噬细胞从血管浸润,加上中枢神经系统固有的小胶质细胞活化、迁移和聚集,引发炎症反应,进一步加重组织损伤。那么,脑缺血后坏死的细胞是否参与调节巨噬/小胶质细胞M1/M2极化方向,及其调控机制研究是亟待解决的核心问题,进一步明确缺血性脑卒中的病理机制,深入研究脑缺血后Necroptosis与炎症反应之间的关系,对临床上脑缺血的治疗和预防具有重要指导意义。为此,我们进行以下实验,探讨Necroptosis对脑缺血后局部巨噬/小胶质细胞极化的作用和机制研究。本课题由以下3部分实验组成。第一部分:小鼠脑缺血后损伤区局部发生Necroptosis的研究【目的】研究小鼠脑缺血后损伤区及周围细胞坏死的细胞类型和动态变化。【方法】用光-化学方法诱导建立小鼠脑缺血模型,于术后1 d、3 d、5 d和7 d采用活体碘化丙啶(Propidium iodide,PI)标记,观察损伤区及周围坏死细胞的数量,分别采用PI与Neu N、GFAP、NG2及Iba-1免疫组化染色光镜下观察PI阳性细胞的类型变化,用Western blot方法检测对照侧和缺血后1 d、3 d、5 d及7 d损伤区RIPK3、MLKL和p MLKL蛋白的表达情况,采用免疫双标染色观察p MLKL与Neu N、GFAP、NG2及Iba-1的共标情况;在电子显微镜下观察缺血区的RIPK3及MLKL蛋白在细胞的超微结构分布情况;另外,我们采用RIPK3和MLKL基因敲除小鼠,观察缺血后7 d和14 d损伤区梗死面积的变化;用前肢活动能力(FLA)测试、Sliding scores和Foot-faults等行为学实验方法检测野生型(Wild type,WT)、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠前肢运动功能的恢复情况。采用TUNEL与Neu N双标染色,观察RIPK3-/-和MLKL-/-对脑缺血后损伤区神经元凋亡的保护作用。【结果】1、用光-化学法成功建立了小鼠脑缺血模型,在损伤后3 d(Days post injury,dpi)时,PI阳性细胞数最多,之后逐渐减少。PI阳性细胞在3 dpi时主要与Neu N双标;在7 dpi时主要与GFAP双标。2、脑缺血后1 d、3 d、5 d和7 d损伤区RIPK3、MLKL和p MLKL蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01)。3、脑缺血后1~3 d,p MLKL阳性细胞主要与Neu N共标,电镜下RIPK3和MLKL免疫阳性的胶体金颗粒主要沉积于神经元胞体内。脑缺血后5~7 d,pMLKL主要与GFAP阳性细胞共标,RIPK3和MLKL免疫阳性的胶体金颗粒主要分布在星形胶质细胞细胞质或细胞膜上。4、脑缺血后7 d和14 d,RIPK3或MLKL基因敲除小鼠前肢活动能力、Sliding scores、Foot-faults测试和不对称指数较WT组小鼠均有不同程度的改善(P<0.05,P<0.01)。5、脑缺血后7 d和14 d,RIPK3和MLKL基因敲除小鼠损伤区面积较WT组损伤面积均明显下降(P<0.05,P<0.01)。6、RIPK3和MLKL基因敲除小鼠在脑缺血后7 d损伤区及周边TUNEL与Neu N双标阳性细胞数量较WT小鼠均明显减少(P<0.05,P<0.01)。【结论】1、小鼠脑缺血后1~3 d损伤区发生了以神经元为主的Necroptosis,而缺血损伤后5~7 d损伤区的Necroptosis以星形胶质细胞为主。2、RIPK3或MLKL基因敲除后,可以减小脑缺血损伤区面积,促进小鼠运动功能恢复,具有神经保护作用。第二部分:小鼠脑缺血后Necroptosis调节局部巨噬/小胶质细胞极化的研究【目的】研究小鼠脑缺血后的Necroptosis对损伤区巨噬/小胶质细胞M1/M2型极化的影响。【方法】在体内,通过建立小鼠光化学脑缺血模型,于损伤后7 d时采用组化和Western blot检测局部Iba-1的表达和分布;用M1型小胶质细胞的标志物i NOS和M2型小胶质细胞的标志物Arginase-1(Arg-1)分别与Iba-1或者F4/80免疫组化双标染色观察巨噬/小胶质细胞极化状态,用Western blot和q PCR检测i NOS和Arg-1在蛋白水平和mRNA水平的表达。同时用q PCR检测TNFα、IL-12、IL-18等M1型相关因子和IL-4、IL-10等M2型相关因子的表达情况。在体外,分别建立神经元和星形胶质细胞氧-糖剥离(Oxygen and glucose deprivation,OGD)模型,分别收集其上清作为条件培养液(Conditioned medium,CM)。用CM分别刺激WT和RIPK3-/-小鼠来源的巨噬细胞,观察其对巨噬细胞的M1/M2型极化状态的影响。另外,对OGD模型处理后的神经元分别检测M1型和M2型巨噬/小胶质细胞释放相关因子的表达。【结果】1、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠脑缺血后损伤区Iba-1的表达较WT组明显增高,有显著性差异(P<0.05)。2、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤区i NOS的蛋白表达水平较WT组明显减少(P<0.05,P<0.01);RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤区i NOS、TNFα、IL-12及IL-18mRNA的表达较WT组也明显降低(P<0.05,P<0.01)。3、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤区Arg-1的蛋白表达水平较WT组明显增加(P<0.05,P<0.01);RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤区Arg-1、IL-4及IL-10 mRNA的表达较WT组明显升高(P<0.05,P<0.01)。4、在体外,OGD处理后的星形胶质细胞和神经元中RIPK3和MLKL蛋白表达水平较对照组(Con)组均明显升高(P<0.01)。5、星形胶质细胞OGD处理后的CM对原代培养的巨噬细胞i NOS和Arg-1表达影响不明显(P>0.05)。6、WT小鼠来源的神经元OGD处理(OGD-WT N)后收集的CM可刺激巨噬细胞的i NOS表达明显增加(P<0.01)。7、与野生型神经元OGD处理组相比,RIPK3-/-小鼠来源的神经元OGD处理(OGDRIPK3-/-N)后收集的CM可使巨噬细胞的i NOS在蛋白和mRNA水平、以及CD86、TNFα和IL-18 mRNA的表达均降低(P<0.05,P<0.01);而Arg-1在蛋白和mRNA水平、以及CD206、IL-4和IL-10 mRNA的表达均明显增加(P<0.05,P<0.01)。8、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤侧BDNF与Iba-1双标细胞数量明显增加,BDNF的表达量较WT组明显升高(P<0.01)。9、RIPK3或MLKL基因敲除对外周血液中单核/巨噬细胞CD86或CD206占CD11b阳性细胞的百分率均无明显影响(P>0.05)。10、与WT组小鼠相比,Caspase-3-/-小鼠脑缺血后损伤侧i NOS的表达量明显升高(P<0.05);而Arg-1的表达水平无明显影响(P>0.05)。【结论】1、小鼠脑缺血或OGD引起的神经元Necroptosis可使巨噬细胞/小胶质细胞向M1方向极化,而星形胶质细胞的Necroptosis对其影响不明显。2、RIPK3或MLKL基因敲除可使小鼠脑缺血后损伤区巨噬/小胶质细胞向M2方向极化。3、RIPK3或MLKL基因敲除小鼠损伤区巨噬/小胶质细胞上调BDNF的表达,这可能是M2型巨噬/小胶质细胞有利于损伤区修复的机制之一。4、RIPK3或MLKL基因敲除对外周血液中固有的单核/巨噬细胞向M1/M2极化均无明显影响。5、阻断凋亡对小鼠脑缺血后损伤区巨噬/小胶质细胞向M2方向极化无明显影响。第三部分:TLRs/My D88通路参与脑缺血后Necroptosis对巨噬/小胶质细胞极化的调控【目的】探索TLRs/My D88信号通路在脑缺血后Necroptosis对巨噬/小胶质细胞极化调控中的作用。【方法】在体内,我们采用免疫组化染色和Western blot等方法检测脑缺血后TLR2、TLR4和My D88的表达情况,并用Western blot和q PCR等方法观察RIPK3和MLKL基因敲除小鼠损伤区TLRs/My D88通路中关键分子的表达变化。此外,我们使用My D88抑制肽(My D88 inhibitory peptides,MIP)阻断该通路,观察MIP对损伤区局部巨噬/小胶质细胞极化的影响以及MIP的神经保护作用,并探讨其可能机制。在体外,建立神经元OGD模型,收集其上清,刺激WT及RIPK3-/-来源的巨噬细胞,观察My D88的表达情况;同时,用MIP刺激原代培养的巨噬细胞,观察MIP对其M1/M2极化的影响。【结果】1、RIPK3和MLKL基因敲除后,脑缺血损伤侧TLR2和TLR4的表达较WT小鼠损伤后明显下降(P<0.05)。2、My D88在脑缺血损伤区的表达较非损伤侧明显升高(P<0.01)。与WT组相比,RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠损伤区My D88的表达明显减少(P<0.05,P<0.01)。3、WT小鼠来源的神经元OGD处理(OGD-WT N)后,My D88的表达明显升高(P<0.05)。与OGD处理的野生型神经元相比,RIPK3-/-小鼠来源的神经元OGD处理(OGD-RIPK3-/-N)可使My D88的表达明显减少(P<0.05)。4、与对照肽组(Control peptide,CP)相比,用MIP处理OGD-WT N后的条件培养液可使巨噬细胞的i NOS在蛋白和mRNA水平、以及CD86 mRNA表达明显减少(P<0.05),而Arg-1在蛋白和mRNA水平、以及CD206 mRNA的表达明显增加(P<0.05)。5、注射MIP后,小鼠脑缺血损伤区i NOS在蛋白和mRNA水平、以及CD86、TNFα和IL-18 mRNA的表达较CP组小鼠损伤区明显减少(P<0.05,P<0.01);而Arg-1在蛋白和mRNA水平、以及CD206、IL-4和IL-10 mRNA的表达较CP组小鼠脑缺血损伤区明显增加(P<0.05,P<0.01)。6、注射MIP后,小鼠脑缺血损伤区及周边TUNEL阳性细胞数量明显减少;与CP组相比,TUNEL与Neu N双标细胞的数量明显减少(P<0.05)。7、与CP组相比,MIP组小鼠损伤侧BDNF的表达量明显升高(P<0.01),且BDNF与Iba-1双标细胞的数量明显增加(P<0.01)。【结论】1、小鼠脑缺血后损伤区TLR4、TLR2和My D88蛋白的表达水平显著上调。2、神经元OGD处理后的条件培养液能上调巨噬细胞My D88的表达。3、RIPK3或MLKL基因敲除可阻断脑缺血或神经元OGD处理所引发的My D88上调。4、MIP可在体内、外重现RIPK3和MLKL敲除对脑缺血引起的巨噬/小胶质细胞极化影响及神经保护作用。