研究背景在全球范围内,肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其中肝细胞癌(HCC,Hepatocellular carcinoma)占所有临床肝癌类型的90%以上。在我国肝癌发病率位于所有癌症发病率的第二位。多种生理病理性因素可以诱发肝细胞癌的发生,而且肝细胞癌被认为是不同的环境危险因素和遗传因素相互作用的结果。多种遗传性因素及其表观遗传调控在肝细胞癌病变中也发挥了重要作用,肿瘤抑制因子p53 蛋白的失活、β-catenin、Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt/mTor蛋白突变引起Wnt/wingless信号通路的异常活化、ErbB受体蛋白家族异常激活和间质上皮转化因子(MET,mesenchymal-epithelial transition factor)受体蛋白的过度表达等均可参与肝细胞癌的致病过程。Rho GTP酶(Rho GTPases)属于Ras超家族蛋白的成员之一,是三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)结合蛋白分子,分子量约为20 kDa-30 kDa,具有GTP酶活性。Rho GTP酶家族包含至少20个成员,其中Cdc42、Racl和RhoA是目前研究最多的Rho GTP酶。RhoA-GTP酶活性主要受鸟苷酸交换因子(Rho guanine nucleotide exchange factors,RhoGEFs)、GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activating proteins,RhoGAPs)和 GDP 解离抑制因子(Rho guanine nucleotide-dissociation inhibitors,GDIs)三种蛋白分子的调控。在多种肿瘤的发生和转移过程中,Rho GTP酶和其下游调节因子的异常活跃可能是癌症发生的重要标志之一。据文献报道在肝细胞癌中,RhoA-GTP酶的异常表达能够直接影响肝细胞癌的细胞增殖、侵袭和转移等病理过程。其中RhoGEFs激活GTPase-RhoA后,处于活化状态的GTPase-RhoA可以与下游ROCK蛋白(Rho相关螺旋激酶,Rho-associated coiled-coil containing protein kinase)相互作用,从而激活ROCK蛋白,后者在肌动蛋白细胞骨架的形成过程中起着核心作用,并且参与了细胞收缩、粘附、迁移、增殖和凋亡等一系列的细胞功能。活化的ROCK蛋白进一步激活下游的ERM蛋白(埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白,ezrin-radixin-moesin),使其磷酸化水平(phospho-ERM,pERM)增加,从而调节多种细胞功能。ARHGEF10L(Rho鸟苷酸交换因子 10L,Rho guanine nucleotide exchange factor 10-Likel),属于鸟苷酸交换因子家族成员(guanine nucleotide exchanging factors,GEFs),它的蛋白结构包括一个经典的Db1结构域、一个潜在的WD40-like结构域和两个可预测的跨膜结构。文献报道,ARHGEF10L可以特异性的诱导无活性RhoA-GDP形式转化为有活性RhoA-GTP形式,从而进一步激活下游分子的活性,但是ARHGEF10L并不参与Rac1和Cdc42的活化过程。另外,最近的文献报道,ARHGEF10L基因上的SNP位点rs2256787和rs10788679与上皮卵巢细胞癌的致病过程密切相关。以上研究提示,ARHGEF10L作为GEFs成员在肿瘤发生中发挥了重要作用。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是由极化的、上皮细胞样形态变成为纤维样、间叶细胞样形态的生物转化过程,表现出高度的细胞迁移和侵袭能力。EMT在肝细胞癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤的增殖、侵袭和转移等病理过程中发挥了重要作用。因此,本研究进一步分析ARHGEF10L与EMT的作用机制。本研究应用分子遗传学方法,通过比较Illumina 384-SNP VeraCode芯片、Sequenom MassARRAYs和TaqMan genotyping三种不同基因分析的结果,分析确定ARHGEF10L基因的单核苷酸多态性(SNPs)是否与多种肿瘤发生存在遗传易感性,尤其是与肝癌的遗传相关性;基于遗传学的研究结果,应用western blot技术和免疫组织化学技术检测ARHGEF10L蛋白在肝细胞癌组织中的表达情况;探究在肝细胞癌细胞系中ARHGEF10L表达对癌细胞的增殖和迁移能力的影响;通过建立肝细胞癌裸鼠成瘤的动物模型,从实验动物学水平验证ARHGEF10L对肝细胞癌的作用;应用表达组学方法研究ARHGEF10L参与肝细胞癌癌变过程的信号通路。本研究探讨ARHGEF10L基因在肝细胞癌致病过程中的作用和分子机制,为进一步治疗肝细胞癌提供了一定的理论基础和应用价值。方法1、为了研究ARHGEF10L基因的单核苷酸多态性(SNPs)与多种肿瘤发生之间的遗传易感性,Illumina 384-SNP VeraCode芯片对SNPs位点rs2245148、rs35812446、、rs12732894、rs12756041、rs10788678、rs1193340、rs1193339、rs10888045、rs74059378、rs12117763、rs12562076、rs3766307、rs35255680进行分子遗传学分析,Sequenom MassARRAYs对SNPs位点rs10888045、rs3753378、rs2244444、rs12067869、rs78944230、rs12562076、rs3766307进行分子遗传学分析,TaqMan genotyping对SNPs rs10888045、rs2244444、rs74059378、rs12732894进行分子遗传学分析,通过比较三种不同基因分析的结果,确定ARHGEF10L基因上的SNPs位点和各种肿瘤尤其是肝癌之间的遗传易感性。2、为了检测ARHGEF10L蛋白在肝细胞癌中的表达情况,本研究在山东大学附属山东省千佛山医院收集临床肝细胞癌组织和癌旁组织标本(n=8),提取组织蛋白,应用western blot方法检测肝细胞癌组织和癌旁组织中ARHGE10L蛋白表达情况。本实验获得山东省千佛山医院伦理委员会批准(批号2015005),并且所有病人已经签署知情同意书。本研究应用肝细胞癌组织芯片(Alenabio,西安,中国),采用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)检测ARHGEF10L蛋白在肝细胞癌组织(n=36)和正常组织(n=8)中的表达情况。3、为了检测ARHGEF10L对肝细胞癌的细胞增殖和迁移能力的影响,本研究建立了肝细胞癌细胞系过表达ARHGEF10L和低表达ARHGEF10L模型。选取两株肝细胞癌细胞系Bel7402和HepG2,应用HiPerFect转染试剂(QIAGEN,Germany)分别瞬时转染小干扰 RNA(Allstars 和 Anti-ARHGEF1OL siRNA),western blot方法检测ARHGE10L蛋白在两株细胞系中的干扰效率;同时,应用PolyJetTM In Vitro DNA转染试剂(SignaGen,USA)分别瞬时转染过表达质粒(pcDNA3.1-RFP和pcDNA3.1-ARHGEF10L-RFP),通过western blot方法检测ARHGE10L蛋白在两株细胞系中的过表达效率。在Be17402和HepG2细胞中,应用Cell Counting Kit-8实验、克隆形成实验和Transwell实验,观察分析干扰和过表达ARHGEF10L对细胞增殖和细胞迁移能力的影响。4、为了验证ARHGEF10L在体内对肝细胞癌的影响,本研究建立了肝细胞癌荷瘤动物模型。选用4-5周BALB/C Nude裸鼠(购自北京维通利华实验动物有限公司),干扰ARHGEF10L的慢病毒表达载体(shARHGEF1OL)以及空白载体(上海吉玛生物公司)转染至Be17402细胞中,皮下注射转染后的Be17402细胞,建立裸鼠成瘤模型。观察裸鼠肿瘤生长情况,测量肿瘤体积大小;利用核磁共振成像技术(MRI,Magnetic Resonance Imaging)检测瘤体弥散加权成像(DWI,Diffusion-weighted imaging)信号强度和肿瘤表观弥散系数值(ADC,Apparent Diffusion Coefficient)的变化情况;并且通过苏木素-伊红染色(HE,Hematoxylin-Eosin staining)观察肿瘤细胞结构的变化情况。5、为了检测ARHGEF10L在肝细胞癌中对RhoA信号通路的影响,本研究在Be17402和HepG2细胞中分别过表达ARHGEF10L,应用Rho Activation Assay Biochem Kit试剂盒(Cytoskeleton,Denver,USA)检测GTP-RhoA、GTP-RhoB和GTP-RhoC活性的变化;在Be17402细胞和HepG2细胞中分别过表达和干扰ARHGEF10L表达,采用western blot方法检测相关蛋白ROCK1、pERM表达水平的变化;在Be17402和HepG2细胞中干扰ROCK1蛋白表达,应用western blot方法检测pERM蛋白表达水平的变化。6、为了检测ROCK1蛋白在肝细胞癌中表达情况,本研究在山东大学附属山东省千佛山医院收集临床肝细胞癌组织和癌旁组织(n=8),提取组织蛋白,应用western blot方法检测肝细胞癌组织和癌旁组织中ROCK1蛋白表达情况。7、为了检测ARHGEF10L在肝细胞癌中对上皮间质转化(EMT)的调控作用,本研究提取裸鼠肿瘤组织蛋白,应用western blot方法检测EMT相关标记物蛋白 E-cadherin、N-cadherin、vimentin、VEGF和Slug变化情况;在肝细胞癌细胞系Bel7402和HepG2细胞中,观察过表达ARHGEF10L对肿瘤细胞形态的影响;在Be17402和HepG2细胞中,采用western blot方法和细胞免疫荧光方法,检测干扰和过表达ARHGEF10L对EMT相关标记蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin和 Slug的影响。结果1、Illumina 384-SNP VeraCode microarrays发现ARHGEF10L基因上SNPs rs35812446、rs12732894、rs74059378和rs12562076位点的等位基因频率、基因型频率在肝癌和健康对照组之间的差异有统计学意义;Sequenom MassARRAY发现SNP rs2244444位点的等位基因频率、基因型频率在肝癌和健康对照组之间的差异有统计学意义;TaqMan基因型分析发现SNP rs2244444和rs12732894位点的等位基因频率、基因型频率在肝癌和健康对照组之间的差异有统计学意义。上述结果表明,ARHGEF10L基因的SNPs rs2244444和rs12732894位点与肝癌致病可能存在遗传易感性。2、肝细胞癌组织的western blot结果和组织芯片的免疫组织化学结果证明,肝细胞癌组织中ARHGEF10L蛋白表达显著高于正常肝组织,说明ARHGEF10L蛋白可能与肝细胞癌的致病过程密切相关。3、Cell Counting Kit-8、克隆形成实验和Transwell实验结果证明,过表达ARHGEF10L可以促进Be17402和HepG2细胞的增殖和迁移能力,小分子RNA干扰ARHGEF10L可以抑制Be17402和HepG2细胞的增殖和迁移能力,说明过表达ARHGEF10L可以增强肝细胞癌的细胞增殖和迁移能力。4、在裸鼠成瘤模型中,与对照组相比,干扰ARHGEF10L表达可以抑制裸鼠肿瘤细胞活性和肿瘤生长,表现为肿瘤体积减少,DWI信号降低,ADC值升高;HE染色结果显示,抑制ARHGEF10L表达的肿瘤组织表现为降低的细胞密度、缺乏紧凑的组织结构以及具有许多类似凋亡形态的细胞。以上结果说明ARHGEF10L具有促进裸鼠体内肝细胞癌细胞生长的能力。5、在Be17402和HepG2细胞中,过表达ARHGEF10L可以促进GTP-RhoA活性的升高,但GTP-RhoB、GTP-RhoC活性无明显变化。在Bel7402和HepG2细胞中,过表达ARHGEF10L可以上调R0CK1、pERM蛋白表达量;相反的,干扰ARHGEF10L表达可以显著下调ROCK1、pERM蛋白表达量;同时抑制ROCK1表达可以降低pERM蛋白表达量。而且,肝细胞癌组织中ROCK1蛋白表达显著高于癌旁组织。以上实验结果说明ARHGEF10L可以通过GTP-RhoA-ROCK1-pERM信号通路调控肝细胞癌的致病过程。6、过表达ARHGEF10L促进Be17402和HepG2细胞形态发生改变,失去了细胞之间的连接,呈现出疏松的成纤维样细胞形态。在裸鼠成瘤模型中,western blot结果证明,抑制ARHGEF10L表达可以降低vimentin、N-cadherin、Slug和VEGF蛋白表达水平,但是E-cadherin蛋白表达没有改变。同时,在Be17402和HepG2细胞中,western blot和细胞免疫荧光的结果证明,过表达ARHGEF10L可以上调vimentin、N-cadherin、Slug蛋白表达和下调E-cadherin蛋白表达;相反的,干扰ARHGEF10L表达可以降低vimentin、N-cadherin、Slug蛋白表达和增强E-cadherin蛋白表达。以上实验结果说明ARHGEF10L能够促进EMT的发生,从而调节肝细胞癌的致病过程。结论1、Illumina 384-SNP VeraCode microarrays、Sequenom MassARRAYs 和TaqMan genotyping三种不同的基因型分析方法发现,ARHGEF1OL基因上的SNP位点rs2244444、rs12732894与肝癌有显著的遗传易感性。2、在肝细胞癌组织中,ARHGEF10L蛋白表达水平显著升高,显示了ARHGEF 10L与肝细胞癌的发生密切相关。3、细胞功能性学实验结果证明,过表达ARHGEF10L可以促进Be17402细胞和HepG2细胞的细胞增殖和细胞迁移能力。4、在裸鼠成瘤模型中,抑制ARHGEF10L表达能够缩小肿瘤体积和降低肿瘤细胞活性,从动物学实验上再次证明ARHGEF10L表达在肝细胞癌的癌变过程中发挥重要作用。5、在Be17402和HepG2细胞中,过表达ARHGEF10L可以刺激GTP-RhoA活性的升高,同时提高了 ROCK1、pERM蛋白表达水平;抑制ROCK1蛋白可以降低pERM蛋白表达水平,证明了ARHGEF10L可以通过GTP-RhoA-ROCK1-pERM信号通路参与肝细胞癌的致病过程。6、过表达ARHGEF10L促进Be17402、HepG2细胞中vimentin、N-cadherin和Slug蛋白水平的升高,同时降低E-cadherin蛋白水平,说明ARHGEF10L可以诱导肝细胞癌EMT的发生,从而促进肝细胞癌的致病过程。以上结果建议,ARHGEF10L在肝细胞癌中高表达,并且通过GTP-RhoA-ROCK1-pERM信号通路和诱导EMT的发生促进肝细胞癌的癌变过程。