慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)和支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性气道炎症性疾病。WHO最新数据显示,全球慢阻肺患者已超过2.3亿,且病死率逐年上升,预计到2020年慢阻肺将成为全球第三大死因。目前,中国约有4.5千万慢阻肺患者,慢阻肺已经成为中国城市第四大死因、中国农村第一大死因。目前,全世界约有3亿哮喘病人,中国约有3千万哮喘患者,是全球哮喘病死率最高的国家之一。慢阻肺和哮喘严重影响患者的生活质量,给患者及家庭、社会造成巨大的经济负担。因此,研究慢阻肺及哮喘的发病机制及有效治疗方法的研究显得非常紧迫。慢阻肺是一种可防可治的慢性气道炎症性疾病,疾病发展过程伴有不完全可逆的气流受限。吸烟是慢阻肺最主要的诱发因素,但其发病机制目前仍未阐明。慢阻肺气道炎症主要为Th1及TC1型免疫反应,中性粒细胞、巨噬细胞以及CD8+T细胞增多,并有粘液高分泌和纤毛粘液清除功能减弱。越来越多的证据表明,慢阻肺的发病过程与气道的免疫反应紧密相关。大量研究表明慢阻肺患者对激素治疗不敏感,吸入激素对炎症细胞的数量以及前炎症介质的释放均无影响。目前对慢阻肺仍缺乏有效的防治手段。一般认为哮喘的发病机制主要涉及Th1/Th2细胞免疫失衡,它是一种以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等炎症细胞参与,气道粘液高分泌、气道高反应性和气道重构为特征的气道慢性炎症性疾病。吸入糖皮质激素是目前治疗哮喘最有效的方法之一,对激素敏感的哮喘病人大多存在嗜酸粒细胞性气道炎症。但有研究表明,部分哮喘患者存在中性粒细胞性气道炎症反应,而这些患者大多为重症哮喘。临床上发现这些重症哮喘患者对糖皮质激素治疗不敏感,表现为激素低效或者激素抵抗。其炎症特征不同于轻度哮喘,而与慢阻肺相似。临床研究发现,慢阻肺和重症哮喘患者中组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的表达水平和活性均显著降低,并可能是导致这些慢性气道炎症患者激素不敏感的重要因素。新近研究表明,以中性粒细胞反应为主的慢性气道炎症与ThI7密切相关。Th17细胞是一类能分泌IL-17A-F以及IL-22等细胞因子的新型效应CD4+T细胞亚群。临床研究发现,IL-17A的表达水平与哮喘病人的病情严重程度呈正相关,重度哮喘患者血清中IL-17A表达水平较轻、中度患者明显增高,激素抵抗的重症哮喘患者IL-17A的水平与气道中性粒细胞数量呈正相关。Th17相关的炎症因子在慢阻肺患者的气道粘液中表达水平增高。这些研究表明,Th17细胞在中性粒细胞性气道炎症的分子发病机制中起重要作用。Th17早期分化依赖于IL-1信号途径与IL-6等的联合作用,而在慢性气道炎症中,这些炎症因子的产生可能与HDAC2有关。HDAC与组蛋白乙酰基转移酶(HAT)两者之间的动态平衡控制着组蛋白的乙酰化水平和染色质的结构,从分子转录水平调控各种炎症基因的表达,从而在慢性气道炎症中起重要作用。HDAC2活性下降增加了组蛋白的乙酰化水平,从而导致NF-κB等转录因子活性增加,相关炎症因子包括IL-6以及pro-IL-1β等表达增高。据此我们假设,HDAC2与IL-17A之间可能存在相互调控作用,HDAC2调控IL-1β和IL-6等炎症因子产生,继而调控Th17的分化和中性粒细胞性气道炎症反应,从而在慢阻肺和重症哮喘的分子发病过程中起关键作用。本课题通过收集慢阻肺及哮喘患者的临床标本,利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠构建慢阻肺及哮喘模型,体外利用人气道上皮细胞,分离培养原代人及小鼠肺成纤维细胞等方法,研究HDAC2及IL-17A相互调控作用在慢阻肺气道重构及哮喘气道炎症中的机制。第一部分HDAC2抑制IL-17A介导的慢阻肺气道重构的机制研究背景及目的:气道重构是慢阻肺发病机制的主要特征之一,目前其发病机制尚未完全阐明。该部分通过收集临床标本(如诱导痰、肺组织),利用转基因小鼠构建熏烟烟雾诱导的慢阻肺模型,体外利用人气道上皮细胞,分离培养原代人及小鼠肺成纤维细胞,探讨HDAC2能否通过调控IL-17A表达缓解慢阻肺气道重构及其相关机制。方法:收集正常健康人及慢阻肺患者的临床资料、肺功能、诱导痰及高分辨率CT(HRCT)评估支气管壁厚度。用ELISA及免疫组化检测诱导痰HDAC2及IL-17A表达。收集慢阻肺合并肺癌患者手术的切除癌旁正常肺组织,用免疫组化及Masson三色染色法分析肺组织HDAC2、IL-17A及胶原表达。利用Spearman分析HDAC2、IL-17A与气道重构(气管壁厚度及胶原沉积)的相关性。同时,利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠(HDAC2+/-,IL-17A-/-)及HDAC2/IL-17A双基因敲除小鼠(HDAC2+/-/IL-17A-/-)构建烟雾暴露诱导慢阻肺模型(100支烟/天,5天/周,连续3个月)。取右肺保存在-80℃,用于提取蛋白和mRNA,用ELISA和RT-PCR法检测相关炎症因子的表达。取左肺支气管肺泡灌洗液(BALF),进行炎症细胞总数与分类计数。肺组织经40%多聚甲醛固定后,制成病理切片苏木精-伊红染色法(HE)观察炎症浸润。用过碘酸希夫反应(PAS)、Masson三色染及免疫组化观察气道重构相关指标包括粘液分泌、胶原沉积及气道平滑肌。分析肺组织HDAC2及IL-17A表达与气道重构的相关性。另一部分小鼠的双肺,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,经过刺激后用流式细胞术检测肺组织中HDAC2及IL-17A及各个T细胞亚型的变化。培养人支气管上皮(HBE)细胞并予香烟提取物(CSE)、HDAC2小干扰(HDAC2 SiRNA)转染干预,利用免疫荧光及RT-PCR检测IL-17A表达水平。取手术切除的肺组织及小鼠肺组织,分离及培养原代肺成纤维细胞,观察IL-17A对成纤维细胞增殖、迁移、胶原沉积及分化的影响。结果:Spearman相关性分析显示慢阻肺患者诱导痰HDAC2和IL-17A表达呈负相关,且与支气管壁增厚相关。慢阻肺患者肺组织中IL-17A表达与肺组织胶原沉积相关。香烟烟雾暴露后的HDAC2+/-小鼠的气道炎症浸润、炎症因子表达及气道重构明显增加,而IL-17A-/-小鼠的气道炎症浸润、炎症因子表达及气道重构明显缓解。HDAC2通过调控Th17细胞向CD4+T细胞分化及气道上皮细胞的维甲酸相关孤儿受体γγt(RORyt)表达抑制IL-17A产生。在体外,IL-17A通过自分泌转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞增殖、迁移、分化及胶原沉积,参与了气道重构。有趣的是,在HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因(即HDAC2+/-/IL-17A-/-小鼠)可以通过抑制气道炎症反应及成纤维细胞活性缓解气道重构。结论:HDAC2通过抑制气道炎症及成纤维细胞活性缓解IL-17A介导的气道重构,提示HDAC2-IL17A信号通路在慢阻肺气道重构起着重要作用,激活HDAC2和/或抑制IL-17A表达可能对缓解慢阻肺患者气道重构有效。第二部分HDAC2与IL-17A相互调控哮喘气道炎症的分子机制研究背景及目的:HDAC2表达下降与哮喘的疾病严重程度相关;然而,导致HDAC2表达下降的原因及其如何调控气道炎症仍然不清楚。另外,IL-17A是否参与了HDAC2表达下降导致的哮喘加重亦不清楚。方法:收集哮喘患者纤支镜活检标本。用免疫组化检测活检标本中HDAC2及IL-17A的表达,分析HDAC2与IL-17A表达的相关性。同时,利用HDAC2、IL-17A基因敲除小鼠(HDAC2+/-,IL-17A-/-)及HDAC2/IL-17A双基因敲除小鼠(HDAC2+/-/IL-17A-、-)构建屋尘螨(HDM)诱导的哮喘模型。取右肺保存在-80℃C,用于提取蛋白和mRNA,用ELISA和RT-PCR法检测相关炎症因子的表达。取左肺支气管肺泡灌洗液(BALF),进行炎症细胞总数与分类计数。肺组织经4%多聚甲醛固定后,制成病理切片苏木精-伊红染色法(HE)观察炎症浸润。用过碘酸希夫反应(PAS)观察粘液分泌。另一部分小鼠的双肺,剪碎后经胶原酶消化,研磨制成细胞悬液,经过刺激后用流式细胞术检测肺组织中HDAC2及IL-17A及各个T细胞亚型的变化。培养人支气管上皮(HBE)细胞并予HDM、IL-17A细胞因子、HDAC2小干扰转染干预,利用免疫荧光及RT-PCR检测炎症因子表达水平。结果:HDAC2在哮喘患者及小鼠肺组织中表达下降,而IL-17A表达水平明显增加,且HDAC2与IL-17A呈负相关。HMD能导致小鼠肺组织及HBE细胞中HDAC2表达下降,而IL-17A表达增加。与野生型(WT)哮喘小鼠相比,HDAC2+/-小鼠的气道炎症及粘液分泌明显增加,同时IL-17A的表达水平增加。相反,IL-17A-/-小鼠能缓解气道炎症、粘液分泌及HDAC2下降水平。HDAC2+/-小鼠中敲除IL-17A基因(即HDAC2+//IL-17A-/-小鼠)能缓解HDA2基因敲除导致的气道炎症及粘液分泌增加。HDAC2表达下降通过调控CD4+T及γδT细胞分化促进IL-17A分泌,进一步恶化哮喘气道炎症反应。在体外,用HDM体外干预HBE细胞,发现HDM能降低HDAC2的表达,这一过程受到IL-17A的调控。利用SiRNA敲除HBE细胞的HDAC2基因后,炎症因子如IL-6、IL-8表达明显升高。相反,利用SiRNA敲除IL-17A基因后,上述炎症因子表达下降。结论:HDM导致HDAC2表达下降,促进了哮喘气道炎症反应。HDAC2与IL-17A之间存在相互调控机制,构成恶性循环,导致哮喘气道炎症反应及粘液高分泌,提示针对HDAC2-IL-17A信号通路靶点治疗可能对缓解哮喘的气道炎症反应及粘液分泌有效,特别是IL-17A增高的重症哮喘患者。