第一部分FSH在卵巢切除后大鼠根尖周炎进展中的作用根尖周炎为口腔科牙体牙髓科临床上的常见病、多发病,病理表现为根尖区牙槽骨破坏伴随着炎性细胞的浸润。根尖周炎的调节机制极其复杂,目前尚未明确。绝经后由于女性机体内内分泌的变化,牙槽骨的密度减低,免疫调控也发生了相应的变化。这些变化对根尖周炎的发生发展尤其是根尖周骨质吸收起到了推波助澜的作用。自Fuller Albright等发现性腺低下导致骨吸收以来,人们一直认为导致绝经后骨质疏松的唯一元凶是雌激素缺乏。事实上,在绝经期雌激素水平迅速降低的同时,垂体分泌的卵泡刺激素(FSH)的水平也急剧升高。此前研究者们认为FSH的作用具有高度的性腺保守性和特异性,在女性中它的主要作用是刺激卵巢卵泡生成和雌激素的产生。然而近期多项研究显示FSH对于骨改建有直接作用。FSH能通过多种途径调节破骨细胞的活性和机体的免疫反应,在绝经后骨吸收过程中起到了重要的作用。根据以上研究我们推测在绝经后根管感染导致的根尖周炎中,除了雌激素外FSH也起到了重要的作用。本研究采用传统的牙髓腔直接暴露于口腔的方法建立的大鼠根尖周炎模型结合卵巢切除,注射亮丙瑞林、卵泡刺激素注射液、促黄体生成素注射液等干扰体内的促性腺激素水平,检测卵泡刺激素(FSH)在绝经后大鼠根尖周炎的作用。同时检测大鼠根尖周炎病损区域破骨细胞,破骨相关因子RANKL/OPG以及炎症相关因子TNFa/IL-1β在不同FSH激素水平条件下不同时期的变化,以明确FSH在绝经后根尖周炎中的作用及作用机制。实验一FSH可促进大鼠根尖周炎所致的骨破坏目的：结合卵巢切除,注射亮丙瑞林、卵泡刺激素注射液、促黄体生成素注射液等干扰体内的促性腺激素水平,检测卵泡刺激素(FSH)在绝经后大鼠根尖周炎的作用,组织学染色观察和分析不同组之间根尖周骨缺损的发展和变化。方法：30只雌性SD大鼠随机分成6小组,每小组5只,(1)sham手术+赋形剂,(2)双侧卵巢切除术(OVX)+赋形剂,(3)双侧OVX+1.6mg/kg亮丙瑞林,(4)双侧OVX+1.6 mg/kg亮丙瑞林+1.85 μg/kg促黄体生成素,(5)双侧OVX+1.6 mg/kg亮丙瑞林+3μg/kg卵泡刺激素和(6)双侧OVX+3 μg/kg卵泡刺激素。切除卵巢一周后行双侧下颌第一磨牙全麻下开髓,术后21天处死取双侧下颌骨。样本经高分辨率X线活体成像系统扫描后脱钙包埋制备成组织切片,通过HE染色观察根尖周病变的炎症变化。实验过程中每周取大鼠的腹股沟静脉血监测血清中激素水平的变化。结果：在sham组雌激素的水平在整个实验过程中一直比较稳定(～-40pg/mL),而行卵巢切除术的各组,术后一周雌激素的水平急剧降低,随后稳定保持在比较低的水平(～10pg/mL)。注射的几种药物对雌激素水平无明显影响。sham组的卵巢刺激素水平比较稳定,无明显变化。卵巢切除术一周后,卵泡刺激素的水平较sham组明显升高,注射FSH注射液之后卵泡刺激素的水平急剧升高。sham组的促黄体生成素水平比较稳定,无明显变化。卵巢切除术一周后,促黄体生成素的水平明显升高,注射LH注射液之后促黄体生成素的水平急剧升高。HE染色可见开髓后21天sham组根尖周组织炎性细胞浸润明显,可观察到大量中性粒细胞、淋巴细胞；可见牙槽骨缺损,部分样本上可观察到脓肿形成；OVX组炎症程度较sham组加重,牙槽骨缺损明显大于sham组,OVX+LE组炎症程度明显减低且根尖区牙槽骨缺损显著减小,注射FSH后炎症程度与OVX组的炎症程度接近,但根尖周骨缺损明显增大,而注射LH组的根尖周骨缺损与注射LE组的的炎症程度与骨缺损大小接近,无明显变化。结论：FSH可促进卵巢切除大鼠根尖周炎的发生发展,加剧根尖周炎所致的骨吸收,提示绝经后FSH水平的升高可加剧根尖周炎的发生发展。实验二FSH加剧绝经后根尖周炎骨吸收的作用机制目的：观察实验一各组大鼠根尖周病发展过程中FSHR的表达及变化,并分析其与破骨细胞,破骨相关因子RANKL/OPG以及炎症相关因子TNFα/IL-1β关系,以探讨FSH参与根尖周炎病理过程的作用及机制。方法：将90只SD雌性大鼠按实验一中的分组情况进行分组,分别于开髓后7、14、21天处死,取双侧下颌骨,固定,脱钙,包埋后制备组织切片,通过TRAP染色法检测和分析破骨细胞的表达与变化,通过免疫组织化学染色法检测FSHR, RANKL/OPG,TNF a和IL-1β的表达与变化。结果：开髓后7天、14天、21天显示OVX组的破骨细胞数目及FSHR、RANKL、 TNFα和IL-1β阳性细胞数目明显多于SHAM组(p<0.01),OVX+LE组与OVX+LE_LH组的破骨细胞数目及FSHR, RANKL、TNFα和IL-1β阳性细胞数目相对于OVX组显著减少(p<0.01),但OVX+LE组与OVX+LE+LH组相比无无统计学差异(p>0.05)。OVX+FSH组与OVX+LE+FSH组与OVX组和OVX+LE组相比,破骨细胞数目及FSHR, RANKL、TNFα和IL-1β阳性细胞数目具有显著差异(p<0.01)。OPG阳性细胞数目在各组之间并未见明显差异。结论：FSH可能是通过活化破骨细胞,上调破骨细胞相关因子RANKL和炎症相关细胞因子TNFa和IL-1β的表达促进绝经后根尖周炎骨吸收。第二部分FSHR在口腔鳞状细胞癌中的表达及作用口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,约占全部头颈部鳞状细胞癌的90%以上,占全身恶性肿瘤的3%-5%。OSCC常常会导致咀嚼、吞咽和语言等的功能障碍并影响患者面部美观。对OSCC早期治疗的成功率可达到80%以上,但大多数患者是在晚期才被诊断,且预后较差。其主要原因在于口腔鳞状细胞癌容易复发和转移。手术后的复发和转移是口腔鳞状细胞癌患者预后较差的主要原因。因此早期发现和阐明OSCC具体分子机制对于OSCC的诊断和治疗十分重要。FSHR是上皮性卵巢癌的重要标记物,近期又被在全身多处肿瘤和肿瘤血管中表达。这些发现提示我们FSHR可能是一个重要的癌症相关分子生物学标记,可为临床决策制定及患者咨询提供有用信息。目前有研究者认为FSHR可作为泌尿生殖系统恶性肿瘤的治疗靶点,证据如下,(1)FSHR在所有的泌尿系统癌症样本的新生血管中表达；(2)FSHR在正常组织中的表达有限；(3)FSHR可能与血管发生和癌症转移的发展相关；(4)FSHR能与循环系统中的配体结合并在结合后与血管内皮细胞发生内化；(5)前列腺癌细胞中有FSHR的表达。目前FSHR在口腔颌面部的报道非常罕见,曾有报道显示在下颌下腺的浆液性上皮细胞、颗粒细胞及大于颗粒曲管的导管上皮细胞的细胞质中检测FSHR表达。FSHR在口腔颌面部肿瘤中的表达目前未见报道。在本部分的研究中,我们收集100例OSCC患者肿瘤组织及癌旁正常上皮制作组织芯片,对组织芯片进行免疫组化染色,并根据免疫组化结果分析FSHR与口腔鳞状细胞癌病人临床病理参数以及病人总体生存之间的关系。并构建FSHR过表达慢病毒载体,感染口腔鳞状上皮细胞系scc25和scc9,从而来模拟体内的状态,以研究FSHR在口腔鳞癌细胞内过表达后对其增殖及迁移能力的影响,以期为口腔鳞状细胞癌恶性表型的控制提供一定的理论依据。实验一人类口腔鳞状细胞癌中FSHR的表达与临床病理相关性研究目的：研究FSHR在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及与临床病理参数和病人生存预后之间的关系。方法：本实验收集了2001年12月至2009年2月于武汉大学口腔医院口腔颌面外科接受手术治疗、经病理确诊为OSCC的肿瘤石蜡组织100例,所有研究对象均签署知情同意书,术前均未接受激光和放化疗。所有患者临床资料及随访资料齐全。每例标本分别取癌旁正常上皮和肿瘤组织的代表性区域,每块组织片2mm,制作组织芯片。利用免疫组织化学方法检测FSHR的表达,分析与临床病理参数和病人生存预后之间的关系。结果FSHR主要表达于口腔正常上皮细胞及肿瘤细胞中,而在肿瘤血管内皮中未见明显的FSHR表达。正常黏膜的染色多集中在棘层以上区域,染色呈现胞膜胞浆着色,在口腔鳞状细胞癌组织中分布于癌巢中心位置的细胞,癌巢周围的细胞染色较中心位置略浅,染色呈现胞膜胞浆着色。患者的肿瘤大小、病理分级、年龄、性别都无显著的相关性。有转移的病人群体中肿瘤区域FSHR表达水平高于无转移的病人群体。(p<0.05)肿瘤组织内FSHR的表达水平与与生存时间显著相关,FSHR表达高者生存数低于FSHR表达低者。结论在口腔正常上皮和口腔鳞状细胞癌组织内存在着FSHR的表达。FSHR在肿瘤组织中的高表达与较差的临床结果有关系,并且与较短的生存期相关；实验二过表达FSHR对scc25和scc9细胞生物学行为的影响目的：1.研究FSHR过表达对scc25和scc9细胞增殖能力的影响；2.研究FSHR过表达对scc25和scc9细胞迁移及侵袭能力的影响。方法1.细胞培养：口腔鳞状细胞癌细胞系scc25和scc9在37℃,5%CO2饱和湿度条件下,常规培养于含10%胎牛血清的DMEM:F121:1培养液中。2. FSHR过表达慢病毒载体的构建：自口腔鳞状细胞癌手术病人的正常癌旁上皮组织中克隆得到FSHR全长,构建及包装慢病毒,慢病毒载体及空载体分别命名为LV-FSHR, LV3.将两种慢病毒载体分别转染scc25和scc9细胞系,并设立空白对照组(Blank).3-4天后,用荧光显微镜观察慢病毒转染率；并同时提取细胞的RNA用荧光定量PCR验证慢病毒的转染效率；4.CCK8方法检测FSHR过表达对scc25和scc9细胞增殖能力的影响：取指数生长期的细胞,消化计数后按接种于96孔细胞培养板中,培养7天,于第0、1、2、3、4天,用酶联免疫检测仪检测各组细胞在450nm处的吸光度值。5. Transwell侵袭实验观察FSHR过表达对scc25和scc9细胞侵袭能力的影响：取无血清细胞悬液100微升,加入包被有Matrigel胶的上室内,下室加入600微.升含10%胎牛血清的DMEM:F121:1培养液,24h后光学显微镜下计数穿膜细胞数目,评估各组细胞的侵袭能力。建立裸鼠肺转移模型体内观察scc25和scc9细胞侵袭能力的影响。6.过表达细胞Real time PCR检测FSHR相关癌基因(FOSB、IL-6、IL-8、 NFKB2、MMP2、MMP14、TGFB2)的变化,以发掘FSHR促进侵袭的作用机制。结果1. FSHR过表达慢病毒转染可以显著升高scc25和scc9细胞内FSHR的mRNA表达的水平；2.应用CCK8法检测FSHR过表达后scc25和scc9细胞的增殖活性,过表达FSHR细胞的增殖活性未见明显差异3. Transwell侵袭实验结果:FSHR过表达组穿膜的scc25和scc9细胞数均明显增多(P<0.05)。裸鼠肺转移模型显示,scc25+FSHR所形成的肺转移肿瘤结节数目明显多于scc25+vector组。4.FSHR可能是通过上调IL6和IL8的表达来促进口腔鳞癌细胞的侵袭。结论FSHR过表达可使鳞癌细胞系的侵袭能力增加,此作用可能是通过上调IL6和IL8的表达来实现的。