莱茵衣藻作为模式物种,在微藻研究中广泛使用。它是目前唯一能在细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传系统中都能进行转化的真核藻类。虽然莱茵衣藻的细胞核转化体系已经较成熟,外源DNA分子能高效整合入细胞核基因组中,但这种整合是随机插入为主。到目前为止莱茵衣藻核基因的定向敲除、替换技术尚未有效建立,如何高效进行基因组特定区域DNA的插入、敲除和替换?成为莱茵衣藻基因编辑的瓶颈。针对莱茵衣藻同源重组效率低的问题,本论文从Ku基因和条件致死基因codA两方面进行研究,探讨衣藻内源Ku基因敲除/失活对其核基组同源重组的影响,探索在莱茵衣藻利用codA进行反向筛选的可能性。实验结果表明:我们能够在内源Ku基因失活藻株的maa7位点整合外源基因,初步完成了基因编辑;codA转基因工程藻生长基本不受影响,仅在5-FC的诱导下死亡,说明了莱茵衣藻反向筛选的可行性。这些均为莱茵衣藻定向编辑技术体系的建立奠定研究基础。具体研究结果如下:1.根据莱茵衣藻密码子偏好性改造大肠杆菌codA基因,获得了长度为1311bp的优化基因(crcodA),并构建了含有热诱导启动子的pJ1D-crcodA表达载体,通过“珠磨法”转入莱茵衣藻CC849细胞核中,经过PCR和测序验证,获得了工程藻codA1和codA3。荧光定量PCR结果表明codA基因在工程藻codA3中的表达量要高于在工程藻codA1中,且热诱导使其在工程藻中表达量提高约1倍。采用5-FC作为致死诱导物的研究发现,当5-FC浓度达到5 mg/mL时会对工程藻产生毒性,并且毒性强弱与藻细胞浓度有关,仅当藻细胞浓度低于8×10~2 cells/m L时,5-FC会导致工程藻codA3细胞死亡。叶绿素含量检测发现5-FC致死诱导后工程藻的叶绿素含量显著降低,较野生型低1倍左右,但热诱导并未对工程藻的叶绿素含量造成显著改变,表明热诱导对5-FC的致死诱导效果影响不大。2.为提高codA在衣藻中的致死效果,用组成型启动子PsaD替换热诱导启动子Hsp70-RBCS2,并进一步构建了crcodA+crupp基因的融合表达载体pDb-crcodAupp。首先根据莱茵衣藻密码子偏好性改造大肠杆菌upp基因,获得了长度为648bp的优化基因(crupp),接着构建了pDb-crcodAupp表达载体,最后通过“珠磨法”将其转入莱茵衣藻细胞核中,获得了高融合表达crcodAupp基因的工程藻upp1和upp2。5-FC致死诱导研究表明,当5-FC浓度为5 mg/mL时会对工程藻产生毒性,当藻细胞浓度低于1×10~5cells/mL时工程藻的生长被显著抑制,而藻细胞浓度低于1×10~3 cells/mL时,所有工程藻都死亡。这表明经改良后codA基因能使莱茵衣藻在特定条件下(添加5-FC)完全死亡,证明利用codA在莱茵衣藻中进行反向筛选是可行的。3.在莱茵衣藻基因组中预测了两个Ku类蛋白基因crKu70,crKu80,并从衣藻突变库中筛选出可能的crKu70,crKu80失活突变藻dKU70和dKU80。划线纯化可能的失活突变藻后,以PCR测序检测它们的基因型。结果显示藻株dKU70基因组在crKu70基因的第8个内含子中发生了外源抗性基因(CIB1 cassette)的反向插入,且抗性基因在插入时丢失了3’末端265个碱基;藻株dKU80基因组在cr Ku80基因的第5个外显子中发生了整个抗性基因的正向插入。该结果从基因水平证实藻株dKU70和dKU80确为内源cr Ku70,cr Ku80失活的突变藻。因Ku类蛋白与DNA损伤修复有关,藻株dKU70和dKU80均对DNA损伤剂敏感,但dKU80较dKU70更敏感。该结果从功能角度进一步验证dKU70和dKU80为内源Ku类基因失活藻。鉴于dKU80的表型更明显,选择该藻进行后续基因编辑研究。4.选取莱茵衣藻内源maa7基因为靶基因,构建了同源重组载体pMD19T-maa7LRhyg,该载体含有由maa7上游1kb、潮霉素抗性基因、maa7下游1kb组成的重组单元。重组载体转化藻株dKU80,通过潮霉素和5-氟吲哚筛选获得转化子。转化子的PCR检测表明,同源重组单元成功在藻株dKU80的maa7基因处发生了基因替换。该结果初步证实内源Ku80基因失活藻株能够在特定位置进行定向基因编辑。综上所述,一方面本研究利用基因工程手段获得了crcodA+crupp基因融合表达的工程藻,证实了codA基因在莱茵衣藻核基因编辑中作为反向筛选标记的可行性;另一方面获得了内源Ku类蛋白失活的突变藻,证实通过同源重组载体的方式能够在crKu80失活藻中初步实现基因组定向编辑。本论文为莱茵衣藻的同源重组技术的开发提供了有益探索,开拓了新思路,为莱茵衣藻定向编辑技术体系的建立奠定基础。