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背景:念珠菌是正常人口腔、消化道及阴道黏膜中常见的寄生菌,属于条件致病性真菌。近年来,由于广谱抗生素、免疫抑制剂、细胞毒药物的广泛应用,使得念珠菌感染的发生率不断上升。大量研究表明,许多口腔黏膜病的发生都与念珠菌感染有关,尤其是白色念珠菌。虽然抗真菌药物氟康唑具有毒性小,抗真菌谱广、口服吸收迅速完全,血脑屏障通透性高等特点,但此类唑类抗念珠菌药物的广泛使用使念珠菌耐药现象日趋严重,而且目前临床上常用的抗真菌药物在高效低毒、抗真菌谱和耐药性方面的评价尚不能令人满意,因此从中草药中寻求抗真菌新药已成为非常重要的研究内容。中药抗真菌剂来源广泛,毒性小,具有广谱性且药效长,在真菌细胞内产生多方面药理效应,作用途径多样化,使抗念珠菌中药的研究成为热点。
目的:测定中药丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸、盐酸小檗碱体外抗白色念珠菌的敏感性,筛选出抗口腔念珠菌感染作用较强的单味中药,寻找来源广泛,毒副作用小,价格低廉的中药,为治疗口腔念珠菌感染的新药开发提供线索思路。
方法:参照美国国家临床试验标准委员会(NCCLS)提出的标准,用微量稀释法分别检测丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸、盐酸小檗碱对27株口腔白色念珠菌分离株和1株标准株ATCC90028的最小抑菌浓度,以氟康唑作为质控药物,ATCC90028做质控菌株,控制实验条件。用棉拭涂擦法收集样本,含有孢子和假菌丝的样本接种于沙氏琼脂培养基上,37℃培养48小时。将菌种转种子科玛嘉显色培养基上,37℃培养48小时,根据培养基上形成菌落的不同颜色来判断念珠菌菌种。取有盖的96孔板,将倍比稀释的药液由高到低的浓度加入96孔板中,每行1-10孔加入药液100μl,11孔加入RPMI1640液体培养基100μl(不含药液)作为阳性对照,12孔加入RPMI1640液体培养基200μl(不含药液)作为阴性对照。在1-11孔中加入菌悬液100μl。每种菌株做一行复孔,平行操作一次。另取一块板用氟康唑及ATCC90028做质量控制。将制备好的培养板放入35℃电热恒温培养箱中湿盒孵育48h。
结果:1.氟康唑对ATCC90028的MIC值为0.25μg/ml,此结果符合NCCLSM27-A2规定的MIC值。从而保证了整个实验的科学性,证实了实验结果的可靠性和可重复性。2.丹皮酚白色念珠菌的MIC值为125.00μg/ml-1000.00μg/ml;丁香酚对白色念珠菌的MIC值为199.50μg/ml-399.00μg/ml;土槿乙酸对白色念珠菌的MIC值为32.00μg/ml-1024.00μg/ml;盐酸小檗碱对白色念珠菌的MIC值为2.50μg/ml-10.00μg/ml。3.除了丁香酚组与土槿乙酸组比较,P=0.202(＞0.05),差异无统计学意义外,其余药物两两比较,差异均有统计学意义。
结论:1.NCCLS推荐的M27-A2微量稀释法结果稳定、重复性好,操作简便,所需的培养基和试剂少,适用于抗口腔念珠菌病药物的筛选。2.丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸、盐酸小檗碱对27株白色念珠菌均有抑菌的作用,其中,盐酸小檗碱的抑菌作用最强,其次为丹皮酚和丁香酚,土槿乙酸的抑菌作用最差。3.中药抗真菌剂来源广泛,毒性小,具有广谱性且药效长,很少出现耐药性,开发抗真菌中药具有良好的前景。