布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病),是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病,该病在全世界大部分地区广泛流行,给全球畜牧业造成严重经济损失。因此,对布鲁氏菌感染的致病机制的研究、研发抗布鲁氏菌病药物及高效安全的疫苗是目前亟待解决的问题。布鲁氏菌作为一种胞内寄生菌,在宿主细胞内生存主要依靠其毒力因子。目前已筛选到200多个毒力因子,其中布鲁氏菌外膜蛋白是重要的毒力因子之一,我们前期研究发现外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中发挥重要作用,但具体的作用机制尚不清楚。本研究旨在筛选与OMP10蛋白结合的巨噬细胞上的互作蛋白,揭示布鲁氏菌外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌的胞内生存过程中的作用机制,为布鲁氏菌病的药物研发提供科学依据。目的:本研究以流产布鲁氏菌2308标准株OMP10蛋白为研究对象,以小鼠巨噬细胞为模型,筛选和鉴定小鼠巨噬细胞上的互作蛋白。(1)获得原核表达纯化的流产布鲁氏菌OMP10蛋白,并对其进行生物信息学分析。(2)筛选M13噬菌体展示文库中与流产布鲁氏菌OMP10蛋白特异性结合的多肽,并通过比对分析得到互作蛋白。(3)多肽转染小鼠巨噬细胞RAW264.7验证对流产布鲁氏菌胞内生存的影响(4)表面等离子共振技术筛选与流产布鲁氏菌OMP10蛋白互作的小鼠巨噬细胞上的互作蛋白。(5)分析流产布鲁氏菌胞内寄生过程中Hsp A8和Rac1基因的表达变化及流产布鲁氏菌的胞内生存能力,确定HspA8和Rac1对流产布鲁氏菌胞内存活的影响。(6)筛选流产布鲁氏菌OMP10蛋白与HspA8和Rac1蛋白的互作结构域,探讨流产布鲁氏菌在胞内生存过程中外膜蛋白OMP10的作用机制。方法:(1)利用基因工程的方法,构建流产布鲁氏菌OMP10蛋白的原核表达载体pET30a-omp10,通过DE3大肠杆菌进行表达纯化,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;利用IDEB在线,对流产布鲁氏菌OMP10蛋白进行生物信息学分析。(2)利用M13噬菌体,以流产布鲁氏菌OMP10为抗原,从NEB噬菌体环形7肽(c7c)库中,经过三轮的生物学淘选,筛选与流产布鲁氏菌OMP10蛋白特异性结合的多肽;以Blast比对,筛选流产布鲁氏菌OMP10蛋白的互作蛋白。(3)利用固相合成法,合成多肽,并建立流产布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞模型,验证多肽对流产布鲁氏菌胞内生存的影响。(4)由于噬菌体展示技术的筛选过程复杂,筛选效率低,为了深入挖掘与流产布鲁氏菌OMP10蛋白的互作蛋白,采用更为简便的表面等离子共振技术(SPR)作为下一步试验的主要方法。即以流产布鲁氏菌OMP10蛋白为诱饵,小鼠巨噬细胞裂解液为库,利用SPR筛选与流产布鲁氏菌OMP10蛋白互作的蛋白。(5)根据文献资料分析选择Hsp A8蛋白(通过噬菌体展示技术和SPR都筛选到HspA8蛋白)和Rac1蛋白(通过SPR筛选到Rac1蛋白)作为流产布鲁氏菌OMP10蛋白的互作蛋白;流产布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞,qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞中HspA8和Rac1基因的转录变化;RNA干扰小鼠巨噬细胞Hsp A8和Rac1基因,检测流产布鲁氏菌的胞内生存能力变化。(6)根据Hsp A8和Rac1蛋白结构域将其分为不同的截短体并连接至p GADT7-载体,流产布鲁氏菌omp10连接至p GBKT7-载体,分别转化Y187和Y2HGold酵母菌;通过自激活检测和毒性检测,检测p GBKT7-omp10的自激活活性及omp10对Y2HGold酵母菌的毒性作用;根据Clontech酵母双杂交试剂盒建立阳性和阴性对照;将重组omp10-Y2HGold酵母菌与不同截短体的Y187酵母菌融合,筛选可以与重组omp10-Y2HGold酵母菌互作的Hsp A8和Rac1不同截短体的Y187酵母菌,确定其互作结构域。结果:(1)成功构建原核表达载体p ET-30a-omp10,且表达纯化获得11.5kDa的OMP10蛋白;Western blot显示OMP10蛋白具有较强的反应原性;IDEB在线分析结果显示,OMP10蛋白有6个T细胞抗原表位为第61-75、60-74、59-73、57-71、18-32、19-33位氨基酸,4个B细胞抗原表位为第20-72、92-97、103-103、107-118位氨基酸,β-转角优势区段位于第20-60位氨基酸,抗原指数优势区段位于第100位氨基酸,亲水性优势区段位于63-69位,分值为6.586,柔韧性优势区段位于21-30位氨基酸。(2)从M13噬菌体展示多肽文库中筛选得到61个多肽;Clustalx等软件分析得到4个多肽(NK-7、KL-7、NS-7、ST-7);Blast比对分析NK-7和KL-7得到流产布鲁氏菌OMP10蛋白的互作蛋白为热休克蛋白71(HspA8)。(3)流产布鲁氏菌侵染已加入多肽的小鼠巨噬细胞,结果NK-7和KL-7多肽对流产布鲁氏菌胞内生存的初期阶段有抑制作用,而NS-7和ST-7对流产布鲁氏菌的胞内生存无影响,说明HspA8可能会抑制流产布鲁氏菌的胞内生存。(4)由于噬菌体展示技术的筛选效率较低,则利用SPR,成功捕获多肽4261个,质谱鉴定得到503个潜在互作蛋白;经生物信息学分析筛选到5个与其功能相关的蛋白,HspA8、Rac1、Eno1、Ndrg1、S100-A6。(5)根据文献资料选择Hsp A8和Rac1作为流产布鲁氏菌OMP10的互作蛋白进行下一步的功能研究。根据HspA8和Rac1基因设计干扰片段,并筛选确定HspA8-mus-480和Rac1-mus-414为最佳干扰片段;流产布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞,Rac1和Hsp A8基因的表达量逐渐上升,分别在4h和8h达到最高点,之后表达量降低;在侵染后2h、4h、8h、12h和24h干扰组的胞内菌数量显著低于未干扰组(P<0.05)。(6)成功构建酵母pGBKT7-omp10(Y2HGold)诱饵菌和酵母分段表达菌pGADT7-HspA8(1-384/385-542/543-646)(Y187)和pGADT7-Rac1(1-197)(Y187),经检测发现诱饵菌pGBKT7-omp10(Y2HGold)无自激活活性,且omp10基因表达对酵母菌无毒性;通过酵母双杂交筛选结果发现Hsp A8(385-542)底物结合域与pGBKT7-omp10可相互作用且Rac1的(1-197)结构域与p GBKT7-omp10可相互作用。结论:研究结果说明流产布鲁氏菌外膜蛋白OMP10在流产布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的过程中与HspA8蛋白和Rac1蛋白相互作用,且流产布鲁氏菌外膜蛋白OMP10会与Hsp A8蛋白的385-542底物结合域互作,与Rac1蛋白的1-197结构域互作,说明HspA8和Rac1是巨噬细胞上与流产布鲁氏菌OMP10蛋白的重要结合位点。