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小鼠成纤维细胞生长因子21 (Fibroblast growth factor21, FGF21)基因是FGF家族的一员,FGF21是最新发现和毛囊发育有关的因子,其功能可能是在次级毛囊发育中促进转变成退行期,因此推测该基因缺失或突变能够促进毛囊发育。CRISPR-Cas9是一种原核生物通过gRNA介导Cas9蛋白对外源DNA进行切割的基因修饰技术。本实验利用CRISPR-Cas9系统通过显微注射法制作FGF21基因全身性敲除小鼠。通过脱毛实验观察小鼠的长毛速度；通过石蜡切片检测小鼠皮肤毛囊的直径和数量；通过实时定量PCR与Western blot技术检测了FGF21基因敲除后小鼠皮肤中与毛囊发育相关基因的表达情况。1.gRNA表达载体的设计与构建根据FGF21基因的编码序列(CDs),用麻省理工学院的CRISPR Design软件(http://crispr.mit.edu/)设计4对长20nt的gRNA,以gRNA-T2为模板进行体外扩增,得到完整的gRNA,其最终PCR产物长度为455bp。用构建好的4个gRNA和hCas9共同转染小鼠胎儿成纤维细胞,设计跨靶位点的PCR引物进行PCR扩增,然后用Surveyor突变检测试剂盒进行检测,从中筛选出敲除效率较高的2个gRNA,以备用于显微注射法制备FGF21基因全身性敲除小鼠。2.利用显微技术制备FGF21敲除小鼠通过显微注射法将FGF21-gRNA和Cas9 mRNA混合物注射到小鼠胞质中。注射340枚胚胎后得到63只新生小鼠,其中有15只杂合小鼠和3只纯合敲除小鼠,总突变率为28.6%。3.FGF21基因敲除小鼠的检测利用脱毛实验、石蜡切片、实时定量PCR、Western Blot技术检测基因敲除小鼠和野生型小鼠。观察脱毛实验发现,与野生型小鼠相比,敲除小鼠长毛速度相对慢且体表没有长出被毛。石蜡切片结果显示敲除小鼠毛囊直径变小,毛囊数量减少。实时定量PCR结果显示,与野生型小鼠相比,敲除小鼠体内FGFR2、AKT和P-catenin的表达量显著降低(P<0.05), GSK-3β的表达量无显著差异(P>0.05)。通过Western Blot结果显示,与野生型小鼠相比,敲除小鼠中ERK1/2、 AKT及磷酸化水平的蛋白表达量均有不同程度的降低；敲除小鼠和野生型小鼠中都没有检测到p-LEF基因的蛋白表达；p-P38的蛋白水平在敲除小鼠中下降。以上结果对进一步了解FGF2对毛囊发育的作用及生长周期调控机制提供了实验依据。