研究背景肺癌目前已跃居全球肿瘤相关死亡的首位,总体五年生存率约为10%-15%。80%以上的肺癌组织学类型为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC),其中包括腺癌、鳞癌以及大细胞癌。尽管铂类为基础的化疗已经提高了晚期非小细胞肺癌的中位生存,但是这类患者的预后仍然很差。随着转化医学的深入研究,分子靶向治疗为非小细胞肺癌的治疗带来突破,自2002年第一个非小细胞肺癌分子靶向药物吉非替尼进入临床实践始,逐步揭开了表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变与 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKIs)疗效的关系,EGFR突变的晚期NSCLC接受EGFR TKI治疗,中位总生存时间已达24-30个月。近10年来,在非小细胞肺癌中,超过50%驱动基因陆续被发现,但仍然有很大部分患者的基因类型未明;同时,随着分子靶向药物耐药的出现,如何克服耐药及寻找新的非小细胞肺癌靶点成为目前非小细胞肺癌治疗的研究热点。细胞间质表皮转化蛋白(mesenchymal-epithelial transition,MET)原癌基因扩增被发现是除EGFR 20外显子T790M突变之后引起TKI耐药的另一重要机制,它通过EGFR旁路激活引起耐药。因此,最初MET扩增作为EGFR-TKI耐药后的旁路活化机制被广为认可。MET蛋白为肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)受体,属于酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptors,RTKs)家族,MET原癌基因定位于人染色体7q21-q31,全长120kb;包含21外显子,20内含子。正常的HGF/MET信号通路在不同细胞、不同分化阶段参与多种生理过程,如胚胎发育过程中控制细胞的迁移,组织损伤后的修复等。MET表达的异常调节有过表达、组成的激酶激活、基因扩增、通过HGF旁分泌和自分泌激活、MET突变以及后继的改变等。早期临床试验联合应用EGFR-TKI和针对MET抑制剂已显示其安全有效。因此,在非小细胞肺癌中,以MET表达异常为靶点的临床试验越来越多,但目前尚未有成功的III期临床试验结果发表,其中一个原因认为MET异常在非小细胞肺癌中具有不同的作用,MET活化在非小细胞肺癌中的作用机制既不能简单地作为EGFR-TKI耐药后的旁路激活途径,也不能等同于经典的表皮生长因子以及随后发现的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、c-ros 原癌基因1酪氨酸激酶(c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1)等这类确认为非小细胞肺癌驱动基因;治疗上需采用不同方案。研究中发现,EGFR-TKI初治的患者即存在MET的原发活化,MET酪氨酸激酶抑制剂对原发MET过表达的患者具有类似的疗效并且相对安全。2011年OU及2014年Schwab分别报道了原发MET扩增患者对MET酪氨酸抑制剂克唑替尼(crizotinib)很好的疗效。2014年ASCO年会上美国的Camidge首次口头报告了克唑替尼治疗原发MET扩增的初步结果。在其研究中,12例可评价疗效的MET扩增晚期非小细胞肺癌患者,根据MET/CEP7比值分为3个等级,≥1.8-≤2.2(低,1例),>2.2-<5(中,5例)以及≥5(高,6例).4例取得部分缓解,[低(n=0),中(n=1;20%)和高(n=3;50%)],中位缓解时间为35周。未出现明显不良反应,结论认为克唑替尼对原发MET扩增的晚期非小细胞肺癌患者安全、有效;广东省肺癌研究所LI等在2014年ESMO上报告了以MET蛋白过表达为靶点筛选患者接受克唑替尼治疗,13例入组患者,6例部分缓解,2例疾病稳定;认为以MET过表达作为分子标志物同样可预测克唑替尼的疗效,并不劣于MET扩增,且比扩增检测方法简便、经济。MET蛋白过表达仍然是一种值得进一步深入研究的靶点,目前的问题是,MET蛋白过表达检测既没有统一的抗体,评分标准还有争议。因此,在不同的资料中,原发MET蛋白过表达在非小细胞肺癌中的发生率及其与年龄、病理类型、性别及分期等临床参素的关系差异很大,让人无法判断;同时,近来的研究发现MET原发激活在非小细胞肺癌中的治疗潜力巨大,而MET抑制剂克唑替尼对原发MET异常激活的疗效及安全性的研究仅数例个案或小样本病例报道,探索原发MET活化分子标志物的选择研究对非小细胞肺癌的治疗意义重大。本课题通过研究中国肺癌患者原发MET蛋白的表达情况,分析与临床病理参数的关系,进一步探讨其对晚期非小细胞肺癌化疗疗效的影响;并通过前瞻性研究探讨克唑替尼对MET过表达患者的靶向性治疗的疗效、安全性,明确MET蛋白过表达是否可作为MET分子标志物预测抗MET靶向药物疗效,为晚期非小细胞肺癌治疗开发新的靶点及进一步临床试验提供理论依据。本研究通过以下三部分进行:第一部分 原发MET蛋白过表达两种检测评分方法的评价目的:研究不同评分标准下原发MET蛋白过表达在NSCLC中的发生率及其与NSCLC临床参数的关系。2.方法:选择广东省肺癌研究所标本库中2013年12月-2014年10月间经病理确诊的肺癌石蜡及冰冻标本397例,包括手术切除肺组织、肺穿刺组织及淋巴结。所有标本为排除了 EGFR、ALK、K-Ras、ROS1 阳性者并具有知情同意书。采用免疫组织化学方法检测冰冻切片MET蛋白表达水平,采用MetMab临床试验所用的评分系统(至少50%的肿瘤细胞中度以上着色为蛋白过表达)及H-score(0-300,其中≥60分为蛋白过表达)评价MET表达[进一步分为≥60分-<100(低),≥100-<300(中),300(高)三组],统计分析采用SPSS 13.0,MET表达与临床因素的关系采用卡方检验。P<0.05为有统计学意义(双侧)。3.结果:根据两种方法来评价MET表达。1)MetMab评分方法:MET阳性表达率为27%(107/397),腺癌高于鳞癌(34.8%vs.5.9%),差异有统计学意义(x2=30.155,P=0.001),不吸烟患者(31.9%)高于吸烟者(22.6%),两者差异统计学意义(x2=4.298,P=0.038);与性别无关(女性26.9%vs.男性27%;x2<0.001,P=0.986),与年龄(x2=0.319,P=0.572)、分期(x2=4.244,P=0.236)均无关。2)H-score评分方法:①以60分为cut-off值,397例标本中有216例高表达(54.4%)。在腺癌中MET阳性发生率更高(61.6%vs.38.4%),而在鳞癌中MET阴性发生率更高,差异有统计学意义(x2=20.740,P<0.001);而与吸烟无关(x2=0.770,P=0.380);与PS评分(x2=0.409,P=0.522)、性别(x2=0.020,P=0.887)、年龄(x2=0.634,P=0.426)、分期(x=4.332,P=0.228)均无关。②以<60分(未表达),≥60分-<100分(低表达),≥100分-<300分(中表达),300分(高表达)为评分标准;低表达组发生率为15.10%(60/397),中表达组发生率为34.80%(138/397),高表达组发生率为4.50%(18/397)。在中高表达组中腺癌高于鳞癌,在低表达及未表达组中鳞癌高于腺癌(x2=30.493,P<0.001);而与吸烟(x2=6.880,P=0.076)、性别(x2=5.369,P=0.147)、年龄(x2=0.841,P=0.840)、分期无关(x2=6.033,P=).110)。4.结论:不同评分标准MET过表达的发生率不同;H-score评分法较MetMab评分法MET 阳性率高;二种评分方法均发现原发MET蛋白过表达与组织类型有关,腺癌高于鳞癌;而与患者年龄、性别和临床分期等临床参数无关。采用H-score方法对MET分值分级可能为更精准的评分标准。第二部分 原发MET蛋白过表达对晚期非小细胞肺癌一线化疗的影响1.目的:探索原发MET蛋白过表达对晚期非小细胞肺癌患者一线化疗疗效的影响2.方法:对第一部分原发MET蛋白过表达病例中接受一线化疗并已评价疗效的112例晚期非小细胞肺癌患者进行分析,截止评价日期为2015年3月20日;疗效评价采用RECIST 1.1疗效评价标准,分别定义为疾病完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)、疾病进展(progressive disease,PD);以及至疾病进展时间(time to progression,TTP);总生存时间(Overall survival,0S)。同时在MET阳性肺癌细胞株H1993中进行验证,以MET阴性细胞H1229对照,采用MTS方法检测细胞对药物敏感性。统计分析采用SPSS 13.0,MET蛋白表达水平与一线化疗疗效的关系采用卡方检验,单因素生存分析用Kaplan-Meier法,各组间比较用log-rank检验,多因素生存分析采用Cox回归。P<0.05为有统计学意义(双侧)。3.结果:112例接受1线化疗并可评价疗效患者。1)采用MetMab评分标准,112例患者中29例为MET阳性(25.9%),其中PR 7例(24.1%),SD 20例(69.0%),PD2例(6.9%);83例MET阴性患者中PR 27例(32.50%),SD 46例(55.40%),PD10例(12.00%);MET阴性患者PR率较MET阳性患者高(32.50%vs 24.10%),但差异无统计学意义(x 2=1.7,P=0.427);表明以MetMab计分标准区分MET阳性和阴性患者对化疗的疗效无明显差异。单因素生存分析显示,112例NSCLC患者中位一线化疗后PFS 5.9月,MET蛋白过表达较不表达者的PFS低(4.6个月vs.6.0个月),但差异无统计学意义(x 2=2.144,P=0.143;)。多因素回归分析显示:PS评分≥2分为一线化疗后PFS不良的独立预后因素(HR=2.578,95%CI:1.205-5.518,P=0.015)。2)采用H-score方法<60分(未表达),≥60分-<100分(低表达),≥100分-<300分(中表达),300分(高表达)为评分标准;112例患者中54例为MET阳性(48.21%),其中低表达组PR 8例(57.10%),中表达组PR 9例(24.30%),高表达组PR 1例(33.33%);各组间差异无统计学意义(x 2=4.570,P=0.206);表明以H-score为计分标准MET阳性和阴性患者对化疗的疗效无明显差异。单因素生存分析显示,MET蛋白不同水平对一线化疗的PFS影响差异无统计学意义(x 2=1.927,P=0.588)。在细胞实验中显示,MET阳性细胞H1993与MET阴性细胞H1299对一线化疗药敏感性无显著差异(多西他赛GI50 48.2nM;107.5nM;SN38 GI50 11.3;14.5 nM),对MET抑制剂反应差别显著(INC280 GI50146.2nM,>1uM;PF04217903 GI50 147.2nM,>3uM)。通过Western blot对二株细胞的下游蛋白检验发现,MET过表达细胞株H1993较MET低表达细胞株H1299磷酸化MET表达高,MET靶向药物通过MET-AKT-ERK轴抑制细胞增殖。4.结论:原发MET蛋白过表达与晚期非小细胞肺癌一线化疗疗效无关。PS≥2分为一线化疗后PFS不良的独立预后因素,原发MET蛋白过表达不是一线化疗疗效的预后因素,细胞实验中MET蛋白过表达可作为靶向治疗的预测指标。第三部分克唑替尼对原发MET蛋白过表达晚期非小细胞肺癌患者的靶向性研究1.目的:前瞻性研究克唑替尼对原发MET蛋白过表达晚期非小细胞患者的疗效及安全性并对其分子标志物进行分析。2.方法:第一部分病例中,以MetMab评分为标准观察MET阳性临床接受克唑替尼靶向治疗的患者,同时对其进行扩增采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)方法进行检测(Cappuzzo评分系统≥5个拷贝数为阳性或者MET/CEP7评分≥1.8为阳性,或者多倍体聚集focus为阳性);患者在确定服药入组前30天内收集数据。基线特征包括人口统计学特征、吸烟指数、体重下降情况、病史、既往治疗和目标疾病的相关信息。分别在入组前7天内、治疗第7天、每8周(±1周)进行肿瘤评价直至影像学证实疾病进展,因研究治疗延迟的后续评价则顺延。采用CTC AE4.0标准,服药者从入组开始不良事件的监测,包括既往治疗的毒性反应和研究治疗期间直到最后一次研究用药结束后30天持续的或新报告的不良反应(Adverse event,AE)或严重不良反应(Serious adverse event,SAE);入组时间为2013年12月,疗效评价截止计算日期为2015年3月。统计分析采用SPSS 13.0,克唑替尼疗效与临床分子病理学特征的关系采用非参数检验,P<0.05为有统计学意义(双侧)。3.结果:2013.12-2014.10,共29例患者接受克唑替尼治疗,其中16例可进行疗效评价。16例均为腺癌。3例女性(18.8%),13例男性(81.2%);中位年龄57岁;16例中8例患者PR(50.0%),2例SD(12.5%),6例PD(37.5%)16例中15例可进行FISH检测,6例FISH阳性患者中5例PR,9例阴性患者中3例PR,1例PD。1例患者因ILD死亡,不能确认是否和服药相关,1例患者出现3度QT间期延长;其余不良反应均为1-2度;其中1-2度恶心12例(75%),食欲下降9例(56.2%),呕吐6例(37.5%),腹泻4例(25.0%),食道不适感4例(25.0%)。以H-score计分,PR患者MET平均分值为 280(110-300),SD 患者 175(110-300),TP 患者 242(190-300);PR 患者 MET评分较高;但差异无统计学意义(P=0.623);患者疗效与性别(P=0.781)、年龄(P=0.406)、吸烟状态(P=0.931)、PS评分(P=0.800)均无关。4.结论:克唑替尼靶向治疗MET过表达晚期非小细胞肺癌患者安全、有效;其疗效与患者的性别、年龄、吸烟状态、PS评分及基因扩增无关。MET过表达可能作为一种有效分子标志物预测MET抑制剂疗效。创新之处:1.本研究兼顾回顾性研究及前瞻性观察病例;2.采用目前常用的二种评分方法进行比较;阐明H-score可能是一种更全面的评分方法;3.明确原发MET过表达不是晚期非小细胞肺癌一线化疗疗效的预后指标;为进一步的临床试验设计提供依据。4.通过前瞻性观察克唑替尼靶向治疗对原发MET过表达非小细胞肺癌的疗效;