目的:针对目前严重危害人类生命健康,居各类死因首位的冠心病,尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI),本研究旨在从调控花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢进而抑制炎症损伤为出发点,利用AMI动物模型与炎症因子诱导心肌细胞凋亡的细胞模型为工具,探索活血益气解毒中药复方芪参颗粒防治AMI抑制心肌细胞凋亡的作用机制。该研究不仅为冠心病的防治提供新的干预环节与作用靶点,更为以炎症与细胞凋亡为基础的其他疾病的预防和治疗提供新的研究思路。方法:1.利用左冠状动脉结扎术制备C57BL/6小鼠AMI动物模型,采用灌胃途径给予中药复方芪参颗粒(QSKL,3.33g/kg)与阳性对照药塞来昔布(Celecoxib,33.3mg/kg)一周;分别于术后24 h(急性期)与7 d(修复期)采用心脏超声评价各组小鼠心功能;通过血生化检测各组小鼠血浆内肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量;采用酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测心肌局部炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的表达;利用放免与蛋白免疫印迹(western blotting,WB)法检测各组小鼠血浆中内皮素(endothelin,ET)、一氧化氮(nitricoxide,NO)以及心肌组织中iNOS与eNOS的表达;利用HE与TUNEL染色法检测各组小鼠的心肌组织中炎症细胞与凋亡细胞的表达;综合以上结果评价芪参颗粒治疗AMI的药效作用。2.采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症模型结合ELISA、WB等方法初步探讨芪参颗粒的抗炎机制;利用CCK8法检测各给药组细胞活力;Griess法检测各组细胞上清中NO水平;ELISA法检测细胞上清中TNF-α,白介素6(interleukin,IL-6)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)含量;WB法检测巨噬细胞胞浆内磷酸化的核转录因子(nuclear transcription factor κB,NF-κB)与环氧酶2(cyclooxygenase 2,COX2)等蛋白的表达。再利用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分化产生的细胞上清作为条件上清,干预H9C2心肌细胞,建立心肌细胞炎症损伤模型;利用CCK8法检测心肌细胞活力,并对细胞上清中NO与LDH水平进行检测。并且,利用该模型探究芪参颗粒抑制炎症损伤抗心肌细胞凋亡的作用机制；采用细胞活力测定结合细胞上清中NO、LDH及胞内PGE2水平评价芪参颗粒药效;WB法检测心肌细胞中COX2的表达水平,利用免疫荧光检测心肌细胞中P-NF-κB的表达水平。采用左冠状动脉结扎术制备C57BL/6小鼠AMI动物模型结合分子生物学技术探讨芪参颗粒多靶点调控AA代谢进而抑制炎症反应的作用机制。利用放免方法检测各组小鼠循环中TXB2,6-keto-PGF1α的含量;WB法检测心肌组织中AA代谢通路相关蛋白分子(如 sPLA2、COX1、COX2、5LOX、15LOX)表达水平。3.利用心肌炎症损伤细胞模型结合AMI动物模型,从体内与体外两个层面揭示芪参颗粒通过抗炎途径抑制心肌细胞凋亡的作用途径及机制。利用Hoechst 33258染色法与线粒体膜电位分析法测定H9C2心肌细胞的凋亡情况;WB法检测心肌炎症损伤模型中各给药组心肌细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达。此外,在AMI动物模型中,采用WB方法检测与凋亡通路相关的蛋白如P53,Bax,Bcl-2,FasL,Caspase3/8/9等的表达水平。结果:1.基于C57BL/6小鼠左冠状动脉前降支结扎模型的芪参颗粒治疗冠心病AMI药效评价研究结果显示,AMI后模型组小鼠的射血分数(ejectionfraction,EF)(vs.Sham,P<0.001)和短轴缩短率(fractional shortening,FS)(vs.Sham,P<0.001)急剧下降,说明造模成功。芪参颗粒组在心梗发生的急性期与修复期内均能显著的改善心功能,具体表现为EF、FS值较模型组(P<0.01)均显著提升。而针对急性期左心室内径(Left Ventricular Internal Diameter,LVID)的扩张,芪参颗粒与塞来昔布组均无明显改善作用。心肌酶谱检测结果显示,芪参颗粒能够有效下调AMI后引发心肌细胞损伤释放的CK-MB与LDH(vs.Model,P<0.05);此外,芪参颗粒显著抑制AMI引发的致炎因子TNF--α(vs.Model,P<0.05),并对ET/NO有下调趋势,但无显著性差异;但WB检测结果显示芪参颗粒能够有效抑制与炎症机制相关的iNOS的表达而非eNOS;HE染色显示,芪参颗粒组小鼠心肌细胞的形态得到明显改善,少见有炎细胞浸润。TUNEL染色显示芪参颗粒能明显抑制AMI小鼠心肌细胞凋亡数量。2.基于LPS诱导RAW264.7、H9C2炎症细胞模型与小鼠AMI动物模型的芪参颗粒调节AA代谢、抑制炎症损伤的机制研究在LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的模型中,Griess法检测提示,不同浓度芪参颗粒能够抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞产生的NO;ELISA结果显示,芪参颗粒与塞来昔布均能有效抑制细胞上清液中相关炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1的释放,并呈现出浓度依赖性;WB检测结果表明,芪参颗粒与塞来昔布均能有效抑制巨噬细胞内P-NF-κB/COX2 的表达。采用1 μg/ml LPS刺激RAW264.7巨噬细胞产生的包含炎症因子的细胞上清作为刺激剂(conditioned medium,CM),干预H9C2心肌细胞,建立心肌细胞炎症损伤模型;结果表明,由CM诱导的心肌细胞炎症损伤模型的细胞死亡率可达40-50%,显著高于LPS或单一炎症因子诱导的死亡率,以此模型为工具进一步探讨芪参颗粒的抗炎作用机制。利用CCK-8法评价芪参颗粒的心肌保护作用,不同浓度芪参颗粒(400,600,800,1000μg/ml)均能显著抑制CM诱导的心肌细胞损伤;对CM刺激H9C2心肌细胞释放的NO和LDH均有显著抑制作用,且具有浓度依赖性;以上均表明芪参颗粒具有良好的心肌炎症损伤保护作用。ELISA法检测结果提示,芪参颗粒能有效抑制CM刺激H9C2心肌细胞后胞内PGE2的释放。WB法检测表明不同浓度芪参颗粒均能下调心肌细胞内COX2的表达；免疫荧光结果提示芪参颗粒能够有效抑制心肌细胞胞浆内P-NF-κB的释放。采用左冠状动脉结扎术制备小鼠AMI动物模型,给予芪参颗粒干预后,放免结果显示,模型组小鼠血浆中TXB2明显升高(vs.sham,P<0.01),6-keto-PGF1α明显降低(vs.sham,P<0.01),而 TXB2/6-keto-PGF1α 比值明显升高(vs.sham,P<0.01);芪参颗粒能够有效的降低循环中TXB2和TXB2/6-keto-PGF1 α的水平,升高循环中6-keto-PGF1α的水平,而塞来昔布组则对6-keto-PGF1α的升高有显著的抑制作用。WB法检测结果显示,芪参颗粒与塞来昔布均能够有效抑制心肌梗死边缘区COX2的表达:但是,与塞来昔布相比,芪参颗粒还可显著抑制AA代谢途径中的其它关键酶如COX1、脂氧合酶(5LOX,15LOX)的表达;另外,芪参颗粒对炎症反应的信号转导通路的JAK2/STAT3也有显著的抑制作用。3.基于心肌细胞炎症损伤模型与小鼠AMI动物模型的芪参颗粒抑制AMI后炎症介导心肌细胞凋亡的机制研究在CM诱导H9C2心肌细胞炎症损伤模型中,通过Hoechst 33258法染色结果显示CM能诱导H9C2心肌细胞发生凋亡;给予不同浓度芪参颗粒(400,600,800,1000 μg/ml)干预后均能有效抑制炎症损伤引发的心肌细胞凋亡的数量。此外,结合Rhodamine 123染色法检测,CM能使心肌细胞内线粒体膜电位丢失,进而引发内源性心肌细胞凋亡;而不同浓度的芪参颗粒干预后,能够显著稳定心肌细胞内线粒体膜电位,并减少心肌细胞由线粒体途径引发的内源性凋亡的细胞数量。WB法结果显示芪参颗粒能够有效下调Bax蛋白的表达、同时上调Bcl-2蛋白的表达。在左冠状动脉结扎术制备的AMI动物模型中,给予芪参颗粒与塞来昔布干预均能抑制梗死边缘区凋亡的心肌细胞数量。WB法结果显示芪参颗粒与塞来昔布能够有效抑制心肌组织中 P53、FasL、Caspase3 以及 Caspase8 的表达(vs.Model,P<0.05);此外,芪参颗粒还能有效抑制心肌组织中COX2、Bax、Caspase9(vs.Model,P<0.05)的表达,并能够上调Bcl-2(vs.Model,P<0.05)的表达。结论:1.前期药效研究提示芪参颗粒能有效改善AMI急性期与修复期左心室功能的急剧下降;针对AMI急性期,芪参颗粒能够减少心肌组织中炎细胞浸润并抑制心肌细胞凋亡的发生与心肌局部的炎症因子的释放,提示芪参颗粒改善AMI急性期心功能的作用机制与抗炎、抗心肌细胞凋亡密切相关。2.芪参颗粒的抗炎机制除与抑制心肌组织中巨噬细胞与心肌细胞内COX2的表达相关,此外,还能够下调巨噬细胞释放炎症因子如TNF-α IL-6、MCP-1,其作用途径与调控NF-κB、JAK2/STAT3等通路蛋白相关;与塞来昔布相比,芪参颗粒的抗炎特色表现为多靶点调控心肌细胞内AA代谢紊乱,尤其是抑制AMI后引发的心肌细胞内sPLA2的表达,并且能够从不同亚型的环氧酶途径、脂氧酶途径调控炎症引发的AA代谢紊乱。3.芪参颗粒能够通过抑制炎症损伤进而调控心肌细胞凋亡,其机制有二:首先,芪参颗粒与塞来昔布对TNF-α与FasL介导外源性凋亡途径中均有显著的抑制作用,具体表现为对TNF-α-NF-κB-P53以及FasL-Caspase8-Caspase3通路的调控作用,且该调控作用与芪参颗粒、塞来昔布均能抑制心肌组织中巨噬细胞内COX2的活性进而减少炎症因子的释放相关;除此之外,芪参颗粒还能够通过抑制心肌细胞内COX2的产生,进而调控线粒体膜上Bax/Bcl-2的表达,抑制Caspase9引发的内源性凋亡途径而抗心肌细胞凋亡,塞来昔布则无此作用。4.本研究通过对中药复方芪参颗粒干预AMI后炎症损伤介导心肌细胞凋亡机制的阐明,为冠心病AMI的治疗提供新的干预途径与治疗思路;为全面揭示中药复方的作用特点及药理机制提供实验依据,同时也为以心肌缺血为基础的冠心病、心衰等重大疾病的新药开发与药理机制研究提供思路与途径。