小泛素样蛋白（SUMO）修饰是真核细胞中重要的翻译后修饰,在维持基因组稳定、调节细胞周期进程、DNA损伤修复等生理过程中扮演了重要角色。SUMO化修饰是一个高度动态、可逆的过程,可被SUMO特异性蛋白酶逆转,这些酶活性的失调会诱导阿尔茨海默症、恶性肿瘤等一系列重大疾病。因此,发展能够在活细胞内原位筛查SUMO特异性酶,并实时监测其活性变化规律的分子工具是重要的科学目标。目前,基于SUMO的化学探针已广泛用于研究SUMO相关酶的活性及功能,但大多局限于在细胞裂解液中开展应用,无法在活细胞内实现对SUMO相关酶活性的实时监测,这将导致细胞质的稀释及蛋白复合物的结构破坏而丧失相关信息。为解决该问题,本研究发展了细胞穿梭型SUMO活性探针,并通过对其蛋白骨架进行化学改造使其可以对活细胞内的特异性蛋白酶进行时间分辨的捕获及分析,具体工作如下:首先,我们发展了一种新型的环状聚精氨酸穿膜肽分子c R10-NHNH2。通过对现有的环状聚精氨酸穿膜肽进行结构改造,将生物正交的反应基团——酰肼引入到穿膜肽的C端,该分子可通过自然化学连接策略与目标蛋白高效连接,进而获得c R10与目标蛋白的偶联产物,并将蛋白递送至活细胞内。在发展了新型细胞穿膜肽分子后,我们进一步制备了细胞穿梭型光控激活的SUMO活性探针。具体策略是在SUMO C端引入光笼基团邻硝基苄基以阻止SUMO与其特异性酶的相互作用从而实现活性的暂时掩蔽,通过365 nm紫外光照射后脱除光笼基团,探针恢复活性进而实时监测特异性酶的活性。但是在合成探针的过程中我们发现在SUMO的Asp63-Gly64位点形成了天冬酰亚胺副产物致使SUMO关键片段获取困难。为此我们将该光笼基团装载至SUMO第64位甘氨酸上,避免了多肽合成中天冬酰亚胺副反应的发生,辅助高效合成SUMO关键片段。经验证,两个光笼基团在365 nm紫外光照射后可以同时高效脱除,一次性获得天然的SUMO活性探针,进而高效铰链SUMO特异性酶。荧光成像实验证明装载c R10的探针能高效地穿膜进入细胞内,进而我们利用该探针首次在活细胞内捕获内源的SUMO特异性酶,为后续在不同生物事件中原位监测SUMO特异性酶活性变化提供了有效的化学工具。