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研究背景阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种典型的神经系统退行性疾病[1]。临床上的表现特征为空间记忆能力损害、执行功能障碍以及人格和行为改变,病因迄今未明。阿尔兹海默症是老年痴呆中最普遍的一种,其主要的病理特征包括胞外淀粉样蛋白的沉积,胞内默症分为家族性和散发性两种类型,前者主要由遗传因素导致,后者主要由遗传因异常磷酸化的Tau蛋白所形成的神经纤维缠结。阿尔兹海素和环境因素共同影响。据《世界阿尔兹海默病报告》显示,到2050年全球阿尔兹海默病患者人数将达到1亿3百万人。因此,对于阿尔兹海默的研究与寻找治疗方法已经迫在眉睫。而研究AD的分子机制对AD的治疗方法的探索有着重要意义。内质网是调控蛋白质进行折叠修饰的重要细胞器,当内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱时会引发内质网应激(ER stress),进而激活未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse,UPR)等信号通路。有研究表明,阿尔兹海默症中Aβ的沉积可能导致神经元中内质网应激的激活,进一步导致UPR。并且AD患者细胞内存在Ca2+浓度升高的现象,可能是由于Aβ影响了 Ca2+的释放。内质网应激激活的主要信号通路有三条,包括PERK通路,IRE1通路,ATF6通路。前两种通路研究较为深入,而关于ATF6通路与阿尔兹海默症的研究却相对较少。因此,本研究基于阿尔兹海默症与内质网应激的关系,侧重研究ATF6信号通路在阿尔兹海默症中的作用机制,探究ATF6在AD病理形成过程中所扮演的角色,以期为AD的治疗寻找新的潜在靶点。研究方法本研究首先在细胞水平探究ATF6作用的下游基因。利用p3xFlag-CMV-14-ATF6真核表达质粒和ATF6敲低质粒,通过瞬时转染神经胶质瘤细胞系LN229进行ATF6的过表达和敲低,应用ELISA方法检测ATF6对Aβ1-42的影响,利用qPCR技术检测AD相关候选基因的表达。利用Western blot方法检测ATF6对AD相关蛋白的表达影响。其次,构建基因启动子荧光质粒,通过ATF6真核表达质粒与启动子荧光质粒共同转染的方法,确定ATF6对基因的启动子的影响。最后,利用阿尔兹海默模型小鼠在动物水平验证ATF6的作用。利用AD模型鼠APP/PS1小鼠,通过侧脑室注射ATF6质粒的方法实现小鼠脑中ATF6的过表达,通过行为学实验Y迷宫及水迷宫检测ATF6对其学习记忆能力的影响。通过ELISA的方法检测ATF6对小鼠大脑皮层中Aβ1-42的影响,利用硫黄素S染色的方法检测ATF6对Aβ蛋白斑的影响。研究结果1.AD模型小鼠与野生型小鼠脑组织ATF6的表达量检测结果发现AD模型小鼠脑中ATF6表达明显降低(P<0.05)。2.在细胞水平过表达ATF6,检测细胞上清中Aβ1-42的水平明显降低(P<0.01),说明ATF6抑制了淀粉样蛋白的形成或者促进了淀粉样蛋白的降解。3.在细胞水平通过qPCR及Western blot检测发现过表达ATF6后,与对照组相比APP蛋白水平明显降低,RNA水平未见显著性差异。ADAM17在蛋白及RNA水平均有显著升高(P<0.05),BACE1则在蛋白及RNA水平均有显著下降(P<0.001)。BACE1的异构体BACE2蛋白及RNA水平均无明显改变。敲低ATF6后得出相同的结果。4.通过双荧光素酶报告基因实验验证ATF6对ADAM1及BACE1的启动子活性的影响。结果发现,ATF6对ADAM17的启动子区无显著影响,而对BACE1的启动子活性有显著抑制作用(P<0.001)。通过启动子预测软件及查阅文献分析对BACE1启动子活性有影响的转录因子主要有SP1,P53,PPARγ,而通过实验证明ATF6作用于BACE1的启动子区并不是通过以上转录因子发挥作用。5.AD模型小鼠侧脑室注射ATF6检测小鼠学习记忆能力。Y迷宫结果发现,与对照组相比,ATF6过表达小鼠的学习记忆能力有显著提高(P<0.05)。水迷宫结果表明注射ATF6的模型鼠的认知功能有显著缓解(P<0.01)。取小鼠脑组织发现注射ATF6小鼠大脑皮层中BACE1水平降低且Aβ蛋白斑减少。6.ATF6可以促进H2S的生成,促进细胞自噬。中枢神经系统中H2S主要由CBS产生。结果发现CBS可以通过促进ATG5巯基化促进自噬,进而缓解AD。但实验证明ATF6对CBS没有影响。7.利用Cre/loxP重组酶系统构建大脑皮层和海马特异性敲除ATF6的AD小鼠模型,先杂交出大脑皮层和海马特异ATF6敲除小鼠后与APP/PS1小鼠杂交得到大脑皮层及海马特异性敲除ATF6的APP/PS1模型小鼠。目前小鼠模型已构建成功,为后续实验奠定基础。研究结论AD模型小鼠脑中ATF6的表达明显降低,ATF6通过抑制BACE1的启动子活性影响了 BACE1的表达,进而影响淀粉样蛋白前体蛋白和Aβ的产生。同时影响了淀粉样蛋白形成过程中的分泌酶的表达。AD小鼠模型侧脑室注射ATF6可以减少小鼠脑中蛋白斑的沉积,并对模型小鼠的学习记忆能力有积极的影响,可以缓解模型小鼠的认知障碍。为ATF6可能作为治疗AD的潜在分子靶点提供了依据。