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目的 1．检测尖锐湿疣(condyloma acuminata，CA)病人外周血及局部皮损组织中的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)DNA存在情况，并进行HPV分型，探讨外周血单一核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中检测到的HPV与局部皮损组织中HPV感染的关系。 2．利用昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type6，HPV6)晚期基因1(late gene one，L1)编码病毒的主要衣壳蛋白。 3．以获得的HPV6 L1蛋白作为抗原，检测CA患者和正常献血员血清中的HPV6 L1 IgG抗体。 材料和方法 1．标本收集及DNA提取 收集30例经临床表现、醋酸白试验及病理诊断的CA患者局部皮损和外周静脉血；20例正常献血员外周静脉血；10例正常儿童血清。采用淋巴细胞分离液从外周静脉血中分离PBMCs。酚-氯仿法分别提取皮损组织、血浆及PBMCs中的DNA。 2．PCR扩增及HPV分型 用粘膜型HPV通用引物MY11／MY09扩增CA患者局部疣组织、PBMCs、血浆和正常献血员PBMCs、血浆中的HPV DNA。采用限制性片段长度多肽性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)方法进行HPV分型，将扩增的450bp产物分别以限制性内切酶Rsa Ⅰ、Pst Ⅰ做酶切分析鉴定。 3．PCR产物的测序 选取3例酶切结果分别为HPV6型、HPV11型、HPV16型的CA患者的皮损与PBMCs的PCR产物按玻璃奶DNA纯化试剂盒回收产物后，连接至克隆载体pGEM-T，进行直接测序。 4．HPV6 L1全长基因的克隆和基因测序 设计HPV6型特异性引物扩增L1全长基因，并在上、下游引物中分别加人BamHI和EcoRI限制性酶切位点识别核耷酸序列。采用HPV6型感染的CA组织标本DNA为模板进行PCR扩增，并将产物回收后连接至PGEM－T载体上，进行克隆和测序。 5．pFASTBacHTb－HPV6 LI供体质粒的构建 将PGEM－T载体上的克隆质粒经BamHI和EcoRI酶切后，与经Burn－HI禾 EcoRI酶切后的 pFASTBacHTb质粒连接，构建p以STBacHTb－HPV6LI供体质粒。 6．重组杆状病毒表达载体的转座反应与重组Bacmid DNA的分离 将供体质粒pFASTBacHTb－HPV6LI转化至大肠杆菌DH10BAC 感受态菌中，与杆状病毒Bacmid DNA进行转座反应，加人SOC培养液37T慢摇培养4h后转移至Luha培养基平板上，37C℃培养36－枯小时至蓝上斑出现。姚取白色菌落在含卡那霉素、庆大霉素、四环素的 LB培养液中 3 7℃振摇培养24h，提取重组杆状病毒Bacmid DNA。 7．Sffi细胞培养、转染和重组杆状病毒的收获、繁殖 草地夜蛾第9号克隆（spodoptera frugiperda，Sfg）细胞在含 10％ 白sfZ4血清Grace培养液中27℃培养。转染在无血清无抗生素的SFM培养液中进行，将重组Bacmid DNA与脂质体的混合物转染至Sfg细胞中，72h后收获上清（此即含重组杆状病毒的原代毒种入Sfg细胞接种原代毒种后，依次获得2代和3代毒种。Sfg细胞大量繁殖、传代，接种3代毒种，收获大量接毒后的Sffi细胞。 8．HPV6 LI DNA和重组蛋白的鉴定 提取接毒后的Sfg细胞DNA和蛋白，分别采用PCR扩增JDS一聚丙烯酚胺凝胶电泳和Western－blot鉴定。 9．HPV6 LI重组蛋白的纯化 将大量接毒后的Sfg细胞经盐酸肌裂解后获得的上清加至处理好的镍柱中，搅拌过夜，收集镍柱沉淀，用离心的方法经含不同咪哩浓度的缓冲液分别洗脱，洗脱液经SDS－PAGE电泳、Western－blot观察纯化情况。 10．ELISA法检测血清中 HPV6 LI IgG抗体 以纯化的HPV6 LI重组蛋白为抗原，采用间接ELISA法检测30例CA病人血清和 20例正常人血清中的 HPV6 LI IgG抗体，以 10例正常儿童血清作阴性对照。 ·2· 11．检测结果的统计学分析 O八’校正检验分析（A组与正常献血员组 PBMCS中 HPV DNA检出率的差异人A组与正常献血员血清中HPV6 LI IgG抗体检出率的差异。 p）Fisher’s精确概率检验人A组中PBMCs的HPV DNA检测结果与临床方面（皮损数目、大小、性别）的相关性人x组中两性间HPV6 LI IgG抗体检出率的差异比较；CA组中 PBMCS HPV DNA阳性组与阴性组 HPV6LI Igh抗体检出率的差异比较。 OH对称资料t检验：用于ELISA检测中血清最佳工作浓度的确定。 结 果 1．CA患者与正常献血员 HPV DNA的检测及分型结果 30例CA患者皮损中均可检出 HPV DNA，血浆中均未检测到 HPVDNA。10例病人PBMCS中检测至uHPV DNA（阳性率为33．3％），而20例正常献血员对照均为阴性，两组在统计学上具有显著性差异。PC R产物RFLP分拆显示血液样本中的HPV型别与其局部皮损的型别一致，其中6例为 HPV 6型；2冽为 HPV型；1例为 HPV型；1例病人局部皮损组织为 HPV 6和门 型混合感染，而 PBMCS为 HPV型。3例病人的 PCR产物经克隆测序证实为各型的HPV LI DNA序列。分析病人临床资料发现PBMCS中HPV DNA阳性患者局部皮损的数量明?