大豆糖蛋白的分离纯化、结构分析及免疫调节功能的研究

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糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子,即是指糖和蛋白质间,以蛋白质为主,其一定部位以共价键与若干糖分子链相连而构成的分子。糖蛋白在自然界广泛存在于动物、植物和某些微生物中,在生物体内以多种形式存在,对生命体起着广泛而重要的作用。本文以大豆中的糖蛋白为研究对象,对其进行分离、纯化、结构鉴定及增强免疫调节能力的研究,以期了解糖链对大豆蛋白性质及功能的影响,为更加广泛和充分地利用大豆提供研究基础。 大豆颗粒经粉碎、干燥、脱脂后,用磷酸盐缓冲液和氯化钠溶液4℃浸提过夜,浸提液用硫酸铵沉淀。以缓冲液pH值、料液比和盐浓度为影响因子,进行三元二次旋转正交实验,得出适合大豆糖蛋白的最佳提取工艺:浸提液pH值6.8,浸提液盐浓度0.15mol/L,料液比1∶10。 浸提液经硫酸铵沉淀后进行离心,用蒸馏水复溶沉淀蛋白,经缓冲液透析平衡、聚乙二醇6000浓缩后,用DEAE-Cellulose 52离子交换层析柱进行初步分离,经磷酸钠缓冲液、0.1mol/L NaCl和0.2mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱后,收集蛋白峰和糖峰的重合峰。收集该峰的蛋白液,经透析和浓缩后上Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化,得到大豆糖蛋白纯品。 大豆糖蛋白的纯品经蛋白质染色和糖染色,证明其是糖蛋白。微量凯氏定氮法测定,该糖蛋白中的蛋白含量为83.01%。苯酚-硫酸显色反应测定,糖蛋白中的糖含量为9.84%。SDS-PAGE电泳检测其有一条带,分子量约为61kDa。圆二色谱图分析表明大豆糖蛋白是典型a-螺旋结构,红外光谱分析其含有a型糖苷键,β-消除反应证明其是O-糖蛋白。消除反应后的糖链由Sephadex G-50凝胶层析柱分离,糖链部分经过衍生化后进行气相色谱分析,结果表明其糖链部分的主要含糖为:鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。对β-消除反应前后的蛋白质进行DSC分析,结果表明,大豆糖蛋白的变性温度为60℃,且该大豆糖蛋白的寡糖链对大豆糖蛋白的抗热变性功能无显著影响。 应用该糖蛋白进行小鼠免疫调节能力实验,大豆糖蛋白对小鼠的免疫器脏/体重比值无显著性影响,对小鼠的碳粒廓清能力、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能以及小鼠的定量溶血能力有显著性影响,表明大豆糖蛋白有明显的增强小鼠免疫调节能力的功能。
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