糖尿病血管病变是糖尿病常见的并发症之一,也是导致糖尿病病人死亡的主要原因。以前的研究已经证明,高糖通过诱发氧化应激和炎症反应造成血管内皮功能障碍。血管内皮功能障碍在糖尿病血管病变的发生发展中发挥着重要的作用。近年来,虽然人们对高糖导致血管内皮细胞氧化应激分子机制进行了深入系统的研究,但绝大部分的研究都关注长时间(持续)高糖对血管内皮细胞或血管内皮功能的影响及其作用机制,短暂高糖刺激对血管内皮细胞的影响尚罕有报道。阐明短暂高糖对血管内皮细胞的影响及其作用机制,不仅对全面认识高糖对血管内皮细胞的功能影响而且对设置高糖对离体培养细胞命运的影响的实验条件都具有重要的意义。研究发现,在人类基因组中仅有<2%的基因序列用于编码蛋白质。剩下的约98%的基因序列转录成大量的非编码转录物,包括微小RNA(micro-RNA,miRNA)和长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)。miRNA是一类长度在~20 nt的非编码小RNA,通过结合靶基因的3’UTR促进靶基因mRNA降解或者抑制mRNA翻译。研究发现,mi RNA广泛参与多种生理和病理过程,包括心血管疾病。例如,mi R-155参与动脉血管重塑过程。miR-29a不仅参与动脉粥样硬化的发生发展,还参与心肌纤维化。miRNA可以与多种分子相互作用,包括mRNA、circRNA和lncRNA。lncRNA是一类长度超过200 nt的非编码RNA,通过在表观遗传调控、转录、RNA加工和翻译水平调节基因的表达而在多种病理生理过程中发挥重要的作用。例如,lncRNA-MALAT1在内皮细胞缺氧情况下表达上调,敲低MALAT1表达可以抑制内皮细胞的增殖。研究发现,lncRNA主要通过竞争性抑制miRNA与其靶基因结合而在转录后水平调节靶基因的表达。例如,肌肉特异性linc-MD1通过吸附mi R-133调节MAML1和MEF2C的表达。心肌凋亡相关lncRNA CARL通过吸附miR-539调节PHB2的表达,并最终通过调节线粒体分裂促进细胞凋亡。目前,高糖影响内皮细胞生物学行为是否与lncRNA表达变化有关尚不清楚。因此,本研究在筛选并验证高糖处理的血管内皮细胞中差异表达的lncRNA的基础上,进一步探索lncRNA在高糖改变内皮细胞命运的作用及分子机制。第一部分MIR181A2HG通过与AKT2 mRNA 3’UTR竞争性结合mi RNAs调节AKT2的表达目的:探索人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在高糖环境中lncRNA的差异性表达,预测并验证能与差异表达的lncRNA结合的miRNA以及miRNA可能的靶基因。方法:1.通过MTS方法检测高糖处理HUVEC不同时间后,HUVEC活力的变化;2.lncRNA芯片联合生物信息学方法检测不同糖浓度处理后的HUVEC中的lncRNA表达变化;3.ceRNA预测分析可能与MIR181A2HG结合的mi RNAs以及这些miRNAs的直接靶基因;4.实时定量PCR验证高糖处理不同时间后MIR181A2HG的表达变化;5.实时定量PCR检测不同浓度葡萄糖5.5 mM和30 mM处理的HUVEC中miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056的表达;6.荧光素酶报告实验和RNA pulldown验证MIR181A2HG与miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056的直接结合和调节作用;7.构建包含miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056结合位点的AKT2 3’UTR序列荧光素酶报告质粒;8.通过实时定量PCR、Western blotting和免疫荧光实验检测过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后AKT2 mRNA和蛋白表达变化;9.免疫荧光实验检测高糖处理后AKT2的表达和定位变化;10.免疫荧光检测过表达和敲低MIR181A2HG后HUVEC中AKT2的表达和定位变化。结果:1.高糖上调MIR181A2HG在HUVEC中的表达与对照组糖(5.5 mM D-glucose)相比,在高糖(30 mM D-glucose)处理HUVEC 24 h后,HUVEC活力明显上升;处理5天后细胞活力开始下降,10天后,细胞活力显著降低;与对照组相比,高糖(30 mM)处理HUVEC 6、12和24 h后细胞中的MIR181A2HG表达明显上升。NCBI的ORF Finder预测结果显示MIR181A2HG不具有蛋白质编码能力,即MIR181A2HG序列上没有氨基酸翻译起始位点处常见的Kozak序列,用phylo CSF及Coding Potential Calculator(CPC)计算MIR181A2HG的编码能力,发现MIR181A2HG的CSF评分低于-500,CPC评分为-1.02524。2.MIR181A2HG特异性的结合miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056生物信息学和ceRNA预测分析发现MIR181A2HG序列中含有miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056的结合位点,miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056可能与AKT2 3’UTR结合。与对照组相比,高糖(30 mM)处理的HUVEC中mi R-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056的表达明显降低;荧光素酶报告实验显示,miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056 mimics与pmirGLO-MIR181-A2HG共转染后,荧光素酶活性分别为对照组的58.52%、48.52%和83.03%;三种miRNA及其对照组分别与pmirGLO-MIR181A2HG mut共转染后荧光素酶活性不受影响;RNA pulldown实验显示,MIR181A2HG可以特异性的结合miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056。3.miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056通过靶定AKT2 3’UTR抑制其表达荧光素酶报告实验显示,mi R-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056 mimics与pmirGLO-AKT2 3’UTR共转染HUVEC后荧光素酶活性分别为对照组的32.41%、41.73%和54.42%;miR-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056 mimics与pmirGLO-AKT2 3’UTR mut共转染细胞后荧光素酶活性没有明显变化,过表达MIR181A2HG后荧光素酶活性明显升高;用shR-MIR181A2HG敲低MIR181A2HG表达后荧光素酶活性显著降低;分别过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后AKT2 mRNA表达水平降低51.92%、47.13%和27.39%;AKT2的蛋白水平降低54.30%、52.70%和27.67%;免疫荧光染色实验显示,过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后AKT2的荧光强度明显降低。这些结果表明,miR-6832-5p、miR-6842-5p和mi R-8056通过直接靶向AKT2 3’UTR而抑制其表达。4.MIR181A2HG上调AKT2的表达过表达MIR181A2HG可以显著上调AKT2的mRNA表达水平,而敲低MIR181A2HG后AKT2的表达水平明显降低。免疫荧光染色结果显示,过表达MIR181A2HG显著增加AKT2的荧光强度,而敲低MIR181A2HG后AKT2的荧光强度显著降低。实时定量PCR显示,与对照组相比,高糖(30 mM)可以显著增加AKT2的mRNA表达水平;Western blotting和免疫荧光染色显示,高糖可以显著促进HUVEC中AKT2的蛋白表达水平;实时定量PCR和Western blotting显示过表达AKT2可以挽救由于shR-MIR181A2HG引起的AKT2的mRNA表达降低。这些结果表明,lncRNA-MIR181A2HG通过吸附miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056解除其对AKT2表达的阻抑。结论:1.高糖短时间处理HUVEC上调MIR181A2HG表达;2.MIR181A2HG特异性的结合miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056;3.miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056通过靶定AKT2 3’UTR抑制其表达;4.高糖诱导下的MIR181A2HG通过吸附miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056促进AKT2的表达。第二部分MIR181A2HG促进HUVEC的增殖、迁移和血管形成目的:探索MIR181A2HG/miRNA/AKT2对HUVEC的增殖、迁移和血管形成的影响。方法:1.MTS方法检测了过表达和敲低MIR181A2HG对HUVEC的活力的影响;2.划痕实验检测过表达和敲低MIR181A2HG对HUVEC增殖和迁移能力的影响;3.Transwell迁移实验检测过表达和敲低MIR181A2HG对HUVEC迁移能力的影响;4.3D-细胞培养技术检测过表达和敲低MIR181A2HG对HUVEC血管形成的影响;5.MTS方法、划痕实验、Transwell迁移实验和3D-细胞培养技术检测高糖处理同时敲低MIR181A2HG对HUVEC的活力、迁移和血管形成能力的影响;6.检测过表达miR-6832-5p、mi R-6842-5p和mi R-8056对HUVEC的活力、迁移和血管形成的影响;7.上述四种方法检测过表达MIR181A2HG基础上敲低AKT2对HUVEC的活力、迁移和血管形成的影响;8.Western blotting检测过表达和敲低MIR181A2HG后细胞增殖标志分子PCNA、血管形成标志物MMP2和VE-cadherin的表达;9.Western blotting检测过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后PCNA、MMP2和VE-cadherin的表达。结果:1.MIR181A2HG促进HUVEC的增殖、迁移和血管形成过表达MIR181A2HG显著增加HUVEC的细胞活力,而敲低该lncRNA后HUVEC的细胞活力明显下降;划痕实验显示,过表达MIR181A2HG后HUVEC的迁移率显著增加,反之敲降MIR181A2HG后HUVEC的迁移率显著降低;Transwell迁移实验表明,过表达MIR181A2HG后细胞的迁移数显著增加,而敲低MIR181A2HG后细胞的迁移数降低;3D-细胞培养技术显示,过表达MIR181A2HG后HUVEC的血管形成能力明显升高,敲低MIR181A2HG后细胞的血管形成能力明显降低;与对照组(5.5 mM)相比,高糖(30 mM)显著促进细胞的增殖能力;敲低MIR181A2HG后高糖促进细胞增殖的作用明显减弱;Transwell迁移实验显示,敲低MIR181A2HG可以抵消高糖(30 mM)对HUVEC的迁移能力的促进作用;3D-细胞培养实验显示,敲低MIR181A2HG可以抵消高糖对HUVEC的血管形成能力的促进作用;过表达MIR181A2HG促进PCNA、MMP2和VE-cadherin的表达,敲低MIR181A2HG后PCNA、MMP2和VE-cadherin的表达明显降低。这些结果表明,MIR181A2HG介导高糖对HUVEC的促增殖作用;MIR181A2HG通过调节MMP2和VE-cadherin促进血管形成。2.mi R-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056抑制HUVEC的增殖、迁移和血管形成过表达miR-6832-5p、mi R-6842-5p和mi R-8056后HUVEC的增殖活性显著降低;划痕实验显示,与对照组相比,过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和mi R-8056后细胞伤痕的愈合能力显著降低,跨过Transwell迁移的细胞数量减少;3D-细胞培养实验显示,过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后形成血管样环状结构显著减少;Western blotting结果证实,过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056可以显著抑制PCNA、MMP2和VE-cadherin的表达。这些结果表明,这三种miRNAs抑制HUVEC增殖和血管形成与下调PCNA、MMP2和VE-cadherin表达有关。3.敲低AKT2消除高糖/MIR181A2HG/miRNA对细胞的增殖、迁移和血管形成的影响过表达MIR181A2HG促进细胞的增殖和迁移,而在过表达MIR181A2HG的基础上敲低AKT2的表达后细胞的增殖活性和迁移能力显著降低;3D-细胞培养实验结果显示,过表达MIR181A2HG促进细胞形成血管样结构,而在过表达MIR181A2HG的基础上敲低AKT2的表达后HUVEC形成的血管样结构被破坏。这些结果表明,AKT2介导MIR181A2HG的促HUVEC增殖、迁移和血管形成作用。结论:1.MIR181A2HG促进HUVEC的增殖、迁移和血管形成;2.mi R-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056抑制HUVEC的增殖、迁移和血管形成;3.敲低AKT2可以消除高糖/MIR181A2HG/miRNA对细胞的增殖、迁移和血管形成的影响第三部分MIR181A2HG/miRNA/AKT2对HUVEC增殖和迁移的影响与糖代谢相耦联目的:探索高糖/MIR181A2HG/miRNA/AKT2对HUVEC增殖和迁移的影响与糖代谢之间的关系。方法:1.化学发光法检测MIR181A2HG、miR-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056和AKT2对细胞合成ATP的影响;2.葡萄糖氧化酶法检测MIR181A2HG、miR-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056和AKT2对细胞摄取葡萄糖的影响;3.糖原含量试剂盒检测MIR181A2HG、miR-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056和AKT2对糖原合成的影响;4.Western blotting检测MIR181A2HG、miR-6832-5p、miR-6842-5p、miR-8056和AKT2对AMPK、GSK3β磷酸化和GLUT1表达影响。结果:1.MIR181A2HG促进HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原过表达MIR181A2HG后HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原显著增加,相反敲低MIR181A2HG合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原减少。2.miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056抑制HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原减少与对照组相比,过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056后,HUVEC中ATP含量、葡萄糖水平和糖原合成能力明显降低。3.AKT2促进HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原与敲低AKT2的HUVEC相比,过表达AKT2后HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原显著增加,说明AKT2介导MIR181A2HG、miR-6832-5p、mi R-6842-5p和mi R-8056对糖代谢的调节。4.MIR181A2HG/miRNA/AKT2促进AMPK和GSK3β磷酸化和GLUT1的表达过表达或敲低MIR181A2HG对GSK3β的总蛋白水平没有明显影响,但MIR181A2HG过表达促进AMPK和GSK3β磷酸化水平,而敲低MIR181A2HG降低AMPK和GSK3β的磷酸化水平。过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和mi R-8056后,AMPK和GSK3β总蛋白水平虽然没有明显变化,但是AMPK和GSK3β磷酸化水平降低。同样,过表达AKT2对AMPK和GSK3β总蛋白水平没有明显影响,但AKT2过表达使AMPK和GSK3β磷酸化水平升高,而敲低使其AMPK和GSK3β磷酸化水平降低。过表达MIR181A2HG后GLUT1蛋白表达升高,而敲低则使GLUT1蛋白表达降低。过表达miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056抑制GLUT1蛋白表达,AKT2促进GLUT1蛋白表达。这些结果说明,高糖/MIR181A2HG/miRNA/AKT2通过促进细胞对葡萄糖的摄取及ATP合成而促进HUVEC增殖和迁移。结论:1.MIR181A2HG促进HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原;2.miR-6832-5p、miR-6842-5p和miR-8056抑制HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原;3.AKT2促进HUVEC合成ATP、摄取葡萄糖和合成糖原;4.MIR181A2HG/miRNA/AKT2促进AMPK和GSK3βL磷酸化水平,促进GLUT1的表达。