基于转录组测序的超积累型东南景天内参基因筛选与HSF基因家族初步分析

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kfqwyf
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超积累型东南景天是于我国东部地区的古老铅锌矿区中发现的一种对镉、铅、锌都具有超积累作用的植物。前人已在生理学水平上对其重金属耐受性及超积累性进行了描述,但由于可供参考的基因序列信息极为有限,目前在该物种中尚未开展大规模的分子生物学研究以阐述其分子机制。为了有效地挖掘与重金属耐受性及超积累性相关的胁迫应答基因,我们对超积累型东南景天进行转录组测序,并在此基础上对RT-qPCR技术所需要的内参基因进行筛选。最后在转录组水平上对超积累型东南景天HSF基因家族成员进行初步分析。本研究主要得出以下结论:1.通过Illumina HiSeqTM2000高通量测序平台对超积累型东南景天进行转录组测序,共得到44,495,628条原始Reads,总碱基数达到8,851,634,796nt。组装后获得4,362,725个Contigs和87,721条Unigene。其中长度在500bp以上的Unigene共27,553个,占Unigene总数的31.41%。经Nr、Nt、SwissProt、GO、COG与KEGG数据库比对之后,共有62,101条Unigene获得了功能注释,占Unigene总数的70.79%。经进一步分析之后,初步地鉴定出470条潜在的重金属胁迫应答Unigene。2.利用生物信息学方法从上述转录组数据中挖掘出10个内参基因的候选基因,包括5个传统内参基因(ACT2,TUB,GADPH,UBC9,EF-1α)和5个使用频率较低的新内参基因(SAND,TIP41,AP-2,TBP,APT)。利用RT-qPCR技术对十个候选基因在镉、铅、锌、铜四种重金属胁迫七个时间点下的表达模式进行测定,通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个算法不同的程序对候选基因的稳定性进行评估,筛选出两个稳定表达的内参基因UBC9和TUB。为了验证其可靠性,将UBC9和TUB分别作为内参基因分析植物螯合肽合成酶(SaPCS)在四种重金属胁迫下的表达模式,结果表明这两个候选内参基因均可以完成对靶标基因RT-qPCR结果的标准化分析。3.利用生物信息学方法从上述转录组数据中初步挖掘出11个具备完整HSF结构域的热激转录因子基因家族成员(SaHsf)。将它们与25个水稻OsHsf基因和21个拟南芥AtHsf基因进行聚类分析,并构建系统发生进化树,结果表明SaHsf基因在热激转录因子三个亚家族A(8个)、B(2个)、C(1个)中均有分布。通过Codon W程序对SaHsf基因家族成员进行同义密码子偏好性分析初步鉴定出28个偏好密码子,近一步分析发现SaHsf基因偏爱以A/T结尾的密码子。利用RT-qPCR技术对镉、铅、锌、铜四种重金属胁迫条件下11个SaHsf基因的表达模式进行分析,从中鉴定出了6个潜在的重金属胁迫应答基因。本研究将为后续深入解析超积累型东南景天对重金属耐受性及超积累性的分子机制提供一定的基因资源与理论依据。
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