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第一部分硅胶膜离心柱核酸提取法抽提日本血吸虫感染家兔模型血清DNA的稳定性目的:验证课题组前期建立的硅胶膜离心柱核酸提取法(简称硅柱法)对日本血吸虫感染家兔血清DNA抽提的稳定性,为研制日本血吸虫病快速核酸诊断试剂盒奠定基础。方法:选取家兔9只,随机分为三组每组3只,按常规步骤每只家兔经腹部感染日本血吸虫尾蚴。组一与组二家兔分别感染500条和200条尾蚴(雌雄各半),并于感染后7w和8w按200mg/kg的剂量给予吡喹酮进行杀虫治疗,组三家兔感染200条日本血吸虫尾蚴未进行治疗。对每只家兔感染前以及感染后lw-17w每周进行耳中动脉采血一次,收集血清在相同条件下利用硅柱法抽提两次,再应用基于SjCHGCS19靶标的巢式PCR法重复检测三次。结果:1.巢式PCR检测结果显示,组一家兔(感染500条尾蚴吡喹酮治疗组)感染后lw-4w两次的阳性检出率均在低水平范围内(11%～56%)波动;5w-7w第一次的阳性检出率在78%～89%之间波动,与第二次阳性检出率的波动范围(89%～100%)不同;经吡喹酮治疗后2w(感染后9w)的阳性检出率急剧下降,9w-17w的阳性检出率均在较低水平内波动。不同病期(早期、急性期及治疗后)硅柱法两次抽提检测的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。硅柱法对感染家兔血清DNA两次抽提检测结果的一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.712>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar检验P>0.05)。2.组二家兔(感染200条尾蚴吡喹酮治疗组)感染后lw-4w第一次的阳性检出率在1 1%～33%之间波动,与第二次阳性检出率的波动范围(11%～44%)不同;5w-7w的阳性检出率均在78%～100%之间波动;经吡喹酮治疗后2w(感染后9w)的阳性检出率急剧下降,9w-17w的阳性检出率均在较低水平内波动。不同病期(早期、急性期及治疗后)硅柱法两次抽提检测的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。硅柱法对感染家兔血清DNA两次抽提检测结果的一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.576>0.4),但在一致性方面存在统计学差异(McNemar检验P<0.05)。3.组三家兔(感染200条尾蚴未治疗组)感染后4w第二次的阳性检出率(22%)高于第一次(11%),感染后6w的阳性检出率第二次达到100%高于第一次(78%);感染后8w-l lw第一次的阳性检出率在67%～88%之间波动,第二次的阳性检出率在33%～67%之间波动;感染后12w-17w的阳性检出率均在较高水平内波动。不同病期(早期、急性期、慢性期、晚期)硅柱法两次抽提检测的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。硅柱法对感染家兔血清DNA两次抽提检测.结果的一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.489>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar 检验 P>0.05)。结论:硅柱法两次抽提的不同感染度家兔血清DNA的阳性检出率均无显著性差异,两次检测结果的一致性均较好。表明硅柱法具有快速简便及稳定性较好等优点,有望进一步构建应用于疫区现场的血吸虫病血清DNA检测试剂盒,具有潜在的应用价值。第二部分基于硅柱法的LAMP用于日本血吸虫感染家兔疾病模型血清DNA检测效果的评价目的:比较硅柱法与传统的酚氯仿法对感染家兔血清DNA的抽提效果,评价基于硅柱法的LAMP对日本血吸虫感染家兔血清DNA的检测效果。方法:选取家兔6只,随机分为两组每组3只,按常规步骤每只家兔经腹部感染日本血吸虫尾蚴。组一家兔感染200条尾蚴并于感染后第6w和7w按200mg/kg的剂量给予吡喹酮进行杀虫治疗,组二家兔感染200条日本血吸虫尾蚴未进行治疗。对每只家兔感染前以及感染后ld-20w每周进行耳中动脉采血一次,20w-28w每两周进行耳中动脉采血一次,收集血清分别用硅柱法与酚氯仿法抽提血清DNA,并应用基于SjCHGCS19靶标的巢式PCR及LAMP法重复检测三次。结果:1.两种血清DNA抽提方法对治疗组家兔(组一)感染后ld-3w的阳性检出率均处于较低水平,酚氯仿法对感染后2w血清DNA的阳性检出率(67%)明显高于硅柱法(11%);感染后4w-6w的阳性检出率显著增高,均高于50%;经吡喹酮治疗后,酚氯仿法对治疗后第2w(感染后第8w)的阳性检出率(89%)高于硅柱法(44%);从治疗后第3w(感染后第9w)开始,两种抽提方法的阳性检出率均在较低水平内波动。两种抽提方法对不同病期(早期、急性期、治疗后)的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。两种抽提方法检测结果的一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.475>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar检验P>0.05)。2.两种血清DNA抽提方法对未治疗组家兔(组二)感染后ld-3w的阳性检出率均较低,感染后2w酚氯仿法的阳性检出率(44%)高于硅柱法(0);感染后4w-7w的阳性检出率显著增高,均高于50%;在感染后8w-22w两种抽提方法的阳性检出率均维持在较高水平略有波动。两种抽提方法对不同病期(早期、急性期、慢性期、晚期)的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。两种抽提方法的检测结果一致性均较好(P<0.00l,Kappa=0.630>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar 检验P>0.05)。3.基于两种抽提方法的LAMP对治疗组家兔(组一)血清DNA感染后ld-4w的阳性检出率相近,均可在感染后第ld检测出阳性,且具有较高的阳性检出率(67%);在感染后5w-6w,两种抽提方法的阳性检出率均高于50%;在经吡喹酮治疗后的家兔血清(7w-28w)中,酚氯仿法抽提的血清DNA的阳性检出率在22%～89%之间波动,硅柱法在11%～78%之间波动。基于两种抽提方法的LAMP对治疗组家兔不同病期(早期、急性期、治疗后)的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。两种抽提方法检测结果一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.416>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar检验P>0.05)。4.基于两种抽提方法的LAMP对未治疗组家兔(组二)血清DNA感染后ld的阳性检出率较高,酚氯仿法的阳性检出率(67%)稍高于硅柱法(56%);在感染后4w-7w两种抽提方法的阳性检出率均高于50%,无明显差异;在感染后8w-llw两种抽提方法的阳性检出率波动较大,酚氯仿法在33%～89%之间波动,硅柱法在33%～78%之间波动;感染后12w-28w酚氯仿法和硅柱法的阳性检出率均在33%～100%之间波动。基于两种抽提方法的LAMP对未治疗组家兔不同病期(早期、急性期、慢性期、晚期)的阳性检出率均无显著性差异(P>0.05)。两种抽提方法检测结果的一致性均较好(P<0.001,Kappa=0.416>0.4),且在一致性方面不存在统计学差异(McNemar检验P>0.05)。5.硅柱法的抽提步骤为5步,少于酚氯仿法(6步),抽提20个样本花费1.5h显著少于酚氯仿法的抽提时间(4h);完成LAMP检测仅需3步比巢式PCR法的检测步骤(5步)更少,检测40个样本所需时间(2h)显著少于巢式PCR法(4.5h)。基于硅柱法的LAMP可显著缩短血清DNA的检测时间。结论:本研究表明硅柱法可以替代酚氯仿法与LAMP结合用于日本血吸虫感染家兔血清DNA的快速检测,且该抽提与检测方法在简便性及快速性方面具有酚氯仿法与巢式PCR法所无法比拟的优越性,有望研发基于硅柱法的LAMP用于血吸虫病现场的DNA检测试剂盒,具有潜在的应用价值。第三部分基于纳米金探针核酸比色分析法的LAMP对日本血吸虫DNA检测体系的建立目的:建立纳米金探针核酸比色分析法的LAMP对日本血吸虫DNA的检测体系,进一步提高LAMP法对日本血吸虫DNA检测的灵敏性与特异性。方法:设计寡核苷酸探针与纳米金颗粒进行连接,连接完成的纳米金探针进行紫外可见吸收光谱检测,判断连接成功与否;利用日本血吸虫成虫DNA模板以及阴性血清DNA模板进行LAMP扩增反应,以通过肉眼能明显区分出阴阳性反应为条件优化纳米金探针核酸比色分析法对LAMP扩增产物的检测条件;对构建的检测体系进行敏感性与特异性分析,并与荧光染料检测法对比,再利用核酸凝胶电泳法对LAMP扩增产物进行验证。结果:1.两次连接结果显示洗涤液在260nm处的吸光度分别为-0.006和0.005 Abs,纳米金探针溶液在260nm处的吸光度分别为0.586和0.532 Abs,在526nm处的吸光度分别为0.505和0.485 Abs。2.基于纳米金探针核酸比色分析法的LAMP对日本血吸虫成虫DNA的检测体系中最适宜的盐浓度(MgSO4)为150mM(终浓度为50mM);纳米金探针溶液与LAMP扩增产物的最合适比例为5:5。3.第一次检测显示纳米金探针的检测灵敏度为1:105,第二次的检测灵敏度为1:106,两次检测的灵敏度与荧光染料法及核酸凝胶电泳法检测的结果一致;除了对日本血吸虫及曼式血吸虫DNA的检测结果为阳性反应外,其余检测结果均为阴性反应,与荧光染料法及核酸凝胶电泳法检测的结果一致。结论:寡核苷酸探针能够成功的连接到纳米金颗粒上,构建的纳米金探针核酸比色分析法的LAMP对日本血吸虫成虫DNA的检测具有较好的检测灵敏性及特异性。有望将其与硅柱法相结合构建用于日本血吸虫病的核酸诊断试剂盒,具有潜在的疫区现场应用价值。