论文部分内容阅读
原发性肺癌是死亡率较高的恶性肿瘤之一,且发病率、死亡率有逐年升高趋势。放疗已成其治疗的主要手段,约85%的肺癌患者需要接受放射治疗。研究表明,电离辐照可通过多种信号传导途径诱导细胞凋亡,达到治疗目的。Caspase-3是Caspase家族中最重要的蛋白酶,是多种凋亡途径的共同下游效应部分,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。本实验通过研究12C6+射线辐照人肺癌细胞株H1299,观察12C6+于不同剂量、不同时间辐照细胞周期和细胞凋亡的动态变化及检测Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax蛋白等的表达,探讨重离子辐照治疗肺癌的理论依据。实验结果如下：1重离子辐照可抑制H1299细胞的增殖流式细胞仪检测了细胞周期的分布情况：随着12C6+辐照剂量的加大,以G2/M期细胞阻滞为主,阻滞程度增加呈剂量依赖性,当12C6+辐照剂量超过6GyE时,G]前期细胞明显增加,出现细胞死亡。重离子束辐照能够有效地抑制肿瘤细胞复制,并促使肿瘤细胞死亡。采用噻唑蓝比色法观察重离子束辐照H1299细胞生长的增殖能力,结果显示随着重离子束剂量增加及培养时间的延长其细胞增殖率逐渐下降,其生长抑制曲线呈剂量-时间相关性。2重离子辐照对H1299细胞凋亡的影响荧光显微镜下观察细胞形态显示,经12C6+辐照后培养24h,可见多数细胞形态变的不规则,细胞核出现碎裂,核固缩及凋亡小体。随着辐照剂量增加,细胞凋亡率增加。流式细胞技术检测也显示了H1299细胞在重离子辐照下,随着剂量的增加细胞凋亡率也明显增加,揭示了重离子可体外诱导H1299细胞凋亡。3重离子辐照与相关凋亡基因的表达Caspase-3活性分析试剂盒检测显示,H1299细胞在重离子辐照后,Caspase-3蛋白酶活性随辐照剂量的增加而增加,揭示重离子辐照可提高Caspase-3蛋白酶活性,且与细胞凋亡率变化呈正相关。Western-blotting法和RT-PCR检测实验结果显示,Caspase-3的基因条带随着剂量加大逐渐加深,表明12C6+辐照可匕调Caspase-3表达,并呈一定剂量依赖；免疫组化检测结果显示了在重离子辐照下,随着辐照剂量的增加,Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表达均有增加,而Bcl-2蛋白表达呈下降趋势,Bcl-2/Bax蛋白比值下降；表明重离子辐照可激活Caspase-3的活性。而Bax的表达上调在一定程度上抑制了Bcl-2蛋白的功能,Caspase-3、Caspase-9蛋白共同参与了细胞凋亡,提示重离子辐照诱导H1299细胞凋亡可能是通过Caspase-3途径调控的。4Caspase-3活性抑制实验：当H1299细胞经Caspase-3抑制剂预处理后,观察培养24h的各组细胞活性和细胞凋亡率显示：Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-fmk)能特异性阻断Caspase-3活性,同时降低细胞凋亡发生。本研究从以上实验中得到下列结论：重离子辐照能够体外抑制H1299细胞增殖。可能是通过激活肺癌细胞H1299内Caspase-3而诱导P53非依赖性细胞凋亡,Caspase-3蛋白表达与辐照敏感性成正比。Caspase-3、Caspase-9蛋白共同参与了细胞凋亡。因此,重离子可能是通过激活H1299细胞内Caspase-3蛋白酶活性并降低Bcl-2/Bax比值而诱导细胞凋亡,Caspase-3蛋白参与了调控肺癌细胞H1299的细胞周期,提示重离子辐照诱导H1299细胞凋亡可能是通过Caspase-3途径调控的。通过调控Caspase-3基因的表达可能改变肿瘤细胞的放射敏感性,这有望为提高肿瘤放射治疗提供新思路与新方法。