【摘 要】
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糖尿病,主要包括1型和2型两种,是全世界第三大严重威胁健康的疾病。胰岛移植是治疗糖尿病的有效策略。然而,胰岛来源是有限的,迫切需要生产更多胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）。利用转基因技术诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞具有广阔的前景。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs）可以低风险大量获得
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:31872529）； 陕西省自然基金重点项目（编号:2019JZ-16）；
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糖尿病,主要包括1型和2型两种,是全世界第三大严重威胁健康的疾病。胰岛移植是治疗糖尿病的有效策略。然而,胰岛来源是有限的,迫切需要生产更多胰岛素分泌细胞（Insulin producing cells,IPCs）。利用转基因技术诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞具有广阔的前景。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,AMSCs）可以低风险大量获得,且具有更高的免疫调节能力,是理想的种子细胞来源。研究表明,单个基因转染诱导的效率并不高。因此,本试验首先验证了Hnf1b基因在体外诱导犬AMSCs向IPCs分化中的作用,在此基础上联合胰岛细胞发育过程中起关键作用的级联调控因子Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1,组成三种不同的多基因共表达腺病毒感染犬AMSCs,重编程其向IPCs分化,进行RT-q PCR、Western-blot、形态学观察、双硫腙染色、糖刺激胰岛素分泌试验等检测,通过对比筛选出最佳诱导组合。研究结果如下:1.构建腺病毒表达载体pAdEasy-Hnf1b,并设计Hnf1b的si RNA,分别转染犬AMSCs,同时配合诱导剂,25 d后结果显示,Hnf1b基因过表达组和沉默组均形成胰岛样细胞团,过表达组的直径大且数量多,双硫腙染色着色更深;过表达组在高糖刺激下分泌的胰岛素量为158.27±9.86μIU/10~5cells,极显著高于对照组（125.23±4.35μIU/10~5cells,P<0.001）;过表达组中胰岛细胞发育相关基因Nkx6.1、Ins表达量较对照组极显著上调（P<0.001）;沉默组在高糖刺激下分泌的胰岛素量为102.36±4.36μIU/10~5cells,极显著低于对照组（P<0.001）;沉默组中胰岛细胞发育相关基因Pdx1、Maf A、Nkx6.1、Pcsk2、Ins表达量较对照组极显著下调（P<0.001）;过表达组细胞免疫荧光结果显示分泌C肽和胰岛素。2.构建pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3（A）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Pax4（B）、pAdEasy-Hnf1b-Pdx1-Ngn3-Nkx6.1（C）三种组合的多基因共表达腺病毒载体,转染293A细胞4 d后,RT-q PCR和Western-blot结果显示,各组合目的基因均有表达。感染犬AMSCs,25 d后,A组、B组、C组均形成胰岛样细胞团,且B组数量最多,双硫腙染色着色最深;高糖刺激下B组的胰岛素分泌量分别为为140.79±3.69μIU/10~5cells,极显著高于A组（64.84±5.36μIU/10~5cells）和C组（120.22±2.15μIU/10~5cells）（P<0.001）;胰岛细胞发育相关基因表达量检测结果显示,除Nkx2.2基因,A组、B组、C组其余基因相对于空载体组显著升高（P<0.01）;B组Pdx1基因m RNA表达量显著高于A组（P<0.01）,高于C组（P<0.05）;B组Pcsk1基因m RNA表达量极显著高于C组（P<0.001）;B组Ins基因m RNA表达量高于A组（P<0.05）,与C组无明显差异性。综上所述,Hnf1b基因对体外诱导犬AMSCs向IPCs分化具有促进作用,将Hnf1b与Pdx1、Ngn3、Pax4、Nkx6.1构成三种不同组合,转染犬AMSCs诱导其向IPCs分化,通过对诱导结果的分析,表明Hnf1b、Pdx1、Ngn3和Pax4基因联合诱导效率最佳,为探究干细胞向IPCs分化的更高效方法提供了新的参考,为糖尿病临床治疗提供新思路。
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