论文部分内容阅读
在动物养殖过程,滥用或非法使用抗菌素和抗球虫药等是造成动物食品安全问题的重要因素之一。本研究以畜牧业中常用的抗菌药（林克酰胺类、大环内酯类、卡巴氧和喹赛多）和抗虫药（马杜霉素和苯并咪唑类）为研究对象,以半抗原设计为切入点,制备特异性或群选性单克隆抗体,并建立相应的胶体金免疫层析（GICA）检测方法。（1）设计合成三种林克酰胺类半抗原及相应的完全抗原,通过小鼠免疫、血清筛选、细胞融合和腹水制备等步骤,得到可同时识别克林霉素（CLIN）、林可霉素（LIN）和吡利霉素（PIR）三种药物的单克隆抗体。在标准品稀释液的优化条件下,该抗体对CLIN、LIN和PIR的半数抑制率(IC50)分别为0.42、3.27和12.8 ng/mL;亲和力常数（Ka）为1.36×1011 L/mol,亚型为Ig2a型;与其他常用的抗生素均无交叉。基于该抗体建立了牛奶、鸡蛋、牛肉和蜂蜜中CLIN、LIN和PIR残留的GICA检测方法。通过试纸条扫描仪的测定,计算得到牛奶中CLIN、LIN和PIR检测限（cLOD）分别为0.04、0.43和7.18μg/L;鸡蛋中CLIN、LIN和PIR的cLOD分别为0.81、1.36和11.06μg/kg;牛肉中CLIN、LIN和PIR的cLOD分别为1.54、1.43和10.58μg/kg;蜂蜜中CLIN、LIN和PIR的cLOD分别为0.16、3.65和20.91μg/kg。可满足食品中林克酰胺类药物的限量要求。且经阳性蜂蜜样本确证,该方法可用于食品中CLIN、LIN和PIR残留检测。（2）针对螺旋霉素（SP）、吉他霉素（KIT）和克拉霉素（CLA）三种大环内酯类药物,通过肟化反应合成相应的半抗原,最终分别制备得到SP、KIT和CLA三种单克隆抗体。这三株抗体的IC50分别是0.43、1.49和0.16 ng/mL;SP抗体是高特异性抗体,与其他大环内酯类药物均无交叉,Ka为4.52×10100 L/mol,亚型为IgG2b型;KIT抗体与交沙霉素(JOS,IC50为2.67 ng/mL)具有较好的交叉,Ka为1.19×109 L/mol,亚型为IgG2a型;CLA抗体与红霉素（ERY）、罗红霉素（ROX）和阿奇霉素（AZI）均具有较好的交叉,其IC50分别为0.52、0.76、0.99 ng/mL,Ka为4.09×109 L/mol,亚型为IgG1型。基于SP抗体建立了牛奶和牛肉中SP残留的GICA检测方法,其cLOD分别是0.22μg/L和0.27μg/kg;在牛奶中SP添加浓度为0.5、1μg/L,牛肉中SP添加浓度为1、5μg/kg时,牛奶和牛肉中SP添加回收率范围为82.3%±15.7%到115%±8.14%,变异系数在5.2%到19.1%之间。基于KIT抗体建立了牛奶和鸡蛋中KIT和JOS残留的GICA检测方法,牛奶中KIT和JOS的cLOD分别是1.51和1.91μg/L;鸡蛋中KIT和JOS的cLOD分别是3.00和2.73μg/kg;在牛奶中KIT和JOS的添加浓度均为4、16μg/L,鸡蛋中KIT和JOS的添加浓度为12、48μg/kg时,GICA法测得的添加回收率范围为79.3%±9.2%到110%±4.7%,变异系数在4.3%到13.8%之间。基于CLA抗体建立了牛奶中CLA、ERY、ROX和AZI残留的GICA检测方法,CLA、ERY、ROX和AZI的cLOD分别为0.095、0.085、0.055和0.17μg/L;在牛奶中CLA的添加浓度为1、2.5μg/L,ERY和ROX的添加浓度为1、5μg/L,AZI的添加浓度为5、10μg/L时,牛奶中这四种药物的添加回收率范围为83.0%±8.0%到102.0%±6.0%,变异系数在3.4%到9.8%之间。此外,所有添加样本均经LC-MS/MS法确证,该方法可用于动物食品中这七种大环内酯类残留的快速检测。（3）基于卡巴氧（CBX）和喹赛多（CYA）化学结构分析,设计合成新型半抗原,最终制备得到可同时识别CBX和CYA的单克隆抗体。该抗体对CBX和CYA的IC50分别是1.84 ng/mL和1.85 ng/mL,Ka为3.19×109 L/moL,亚型为IgG2a型,与QCA交叉反应率为7.30%,与其他喹噁啉药物均无交叉。基于该抗体建立了鸡肉中CBX和CYA残留的GICA检测方法,其cLOD分别是2.92μg/kg和2.68μg/kg;CBX（或CYA）添加浓度分别为4、8和12μg/kg时,GICA法测得的添加回收率范围为89.5%±8.9%到109.6%±10.3%,变异系数在9.0%到14.6%之间。经LC-MS/MS确证,该方法可用于鸡肉中CBX和CYA残留的快速检测。（4）以马杜霉素（MD）原药为半抗原,制备得到高特异性的MD单克隆抗体,该抗体的IC50为3.75 ng/mL,Ka为3.70×1010 L/moL,亚型为IgG3型,与其他聚醚类药物均无交叉。基于MD抗体建立鸡肉和鸡蛋样本中MD残留的GICA检测方法,其cLOD为5.51μg/kg和6.46μg/kg;在添加浓度为10和20μg/kg下,添加回收率范围为88.7%±3.9%到105.6%±5.4%,变异系数在4.4%到5.2%之间。经LC-MS/MS确证,该方法可用于鸡肉和鸡蛋中MD残留的快速检测。（5）选择类似物2-甲氧基羰基氨基-1H-苯并咪唑-6-羧酸作为半抗原,制备得到苯并咪唑类（BZs）群选性单克隆抗体,该抗体对阿苯达唑（ABZ）、阿苯达唑亚砜（ABZSO）、阿苯达唑砜（ABZSO2）、芬苯达唑（FBZ）、芬苯达唑砜（FBZSO2）、氟苯达唑（FLU）、甲苯达唑（MBZ）、帕苯达唑（PBZ）、奥芬达唑（OFZ）、丙氧苯咪唑（OXI）、多菌灵（CAR）的IC50分别是0.66、2.91、5.34、0.75、6.27、0.37、0.30、1.13、19.99、0.64、14.84 ng/mL,Ka为1.07×1010 L/mol,亚型为IgG2a型。基于该抗体牛奶中11种BZs残留的GICA检测方法,牛奶中ABZ、ABZSO、ABZSO2、FBZ、FBZSO2、FLU、MBZ、PBZ、OFZ、OXI、CAR的cLOD分别是0.83、0.77、1.83、0.98、7.67、3.50、3.96、5.71、0.92、0.59、1.69μg/L。可满足牛奶中BZs残留的限量要求。