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背景:ANXA3 33-kDa是Annexin 3（ANXA3）的一个亚型,由外显子III选择性剪接产生。ANXA3异常表达与肿瘤发生发展、转移及耐药相关。以往研究集中于ANXA3蛋白整体或36-kDa的作用,而33-kDa亚型在肿瘤中的作用研究匮乏。近年研究发现,ANXA3 33-kDa亚型在来源于肾癌组织经原代培养后的肾癌细胞和肝癌中均高表达,提示ANXA3 33-kDa亚型异常表达与肿瘤进展相关。目的:1、检测HepG2中ANXA3 33-kDa的表达水平;2、构建干扰ANXA3表达的真核表达载体,将其转染到HepG2,筛选ANXA3 33-kDa稳定下调且36-kDa亚型水平无明显变化的HepG2单克隆细胞株;3、探究ANXA3 33-kDa下调对HepG2体内外增殖、克隆形成、迁移侵袭、细胞骨架、血管形成、凋亡及耐药性的影响;4、研究ANXA3 33-kDa调控HepG2恶性表型和耐药性的机制;5、探究ANXA3 33-kDa下调对HepG2裸鼠移植瘤生长的影响和机制。方法:1、Western Blot检测HepG2中ANXA3水平;2、依据ANXA3的mRNA序列（NM005139）,利用Si Direct和Whitehead软件设计针对ANXA3基因的shRNA及无关序列NC（negative control）,构建p GPU6/GFP/Neo-shAnxa3及p GPU6/GFP/Neo-shControl表达载体;3、利用Lipofectamine 2000介导法,将表达载体转染至HepG2,利用Western Blot检测ANXA3 33-kDa在各单克隆细胞株中水平,筛选ANXA3 33-kDa稳定下调的单克隆细胞株;4、MTT和平板克隆形成法分析ANXA3 33-kDa下调对HepG2体外增殖、克隆形成能力影响;5、细胞划痕法、激光扫描共聚焦显微镜结合Transwell小室法考察ANXA3 33-kDa下调对HepG2迁移侵袭能力的影响;6、运用体外血管形成实验探究ANXA3 33-kDa下调对HepG2诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管形成能力的影响;7、采用Annexin V/PI凋亡染色法研究ANXA3 33-kDa下调对HepG2凋亡影响;8、MTT法结合台盼蓝计数法探究ANXA3 33-kDa下调对HepG2耐药性影响;9、Hoechst 33258凋亡染色及Annexin V/PI凋亡染色法检测ANXA3 33-kDa下调对顺铂和5-fluorouracil诱导HepG2凋亡的影响;10、Western Blot探究ANXA333-kDa调控HepG2恶性表型和耐药性的机制。11、裸鼠皮下成瘤实验考察ANXA3 33-kDa下调对HepG2裸鼠移植瘤生长的影响;12、免疫组化法检测HepG2裸鼠移植瘤中ANXA3、Ki-67、Bcl-2和Bax表达水平。结果:1、ANXA3 33-kDa在HepG2中高丰度表达;2、构建pGPU6/GFP/NeoshAnxa3/Control干扰载体,获得ANXA3 33-kDa稳定下调的单克隆细胞株,shANXA3-1和shANXA3-2组中ANXA3 33-kDa表达量较shControl组分别降低100%和98.1%,36-kDa表达量无明显变化;3、与shControl组相比,shANXA3-1组体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力分别降低20.8%（P<0.0001）、44.5%（P=0.0066）、58.5%（P=0.0005）、45.0%（P=0.0195）;shANXA3-2组体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力分别降低15.7%（P=0.0016）、42.1%（P=0.0148）、55.1%（P=0.0041）、41.5%（P=0.0004）;4、shANXA3-1和shANXA3-2组较shControl组迁移距离都显著缩短,伤口愈合能力显著降低（P=0.005,P=0.0082）;shANXA3-1和shANXA3-2组较shControl组骨架排列紊乱,模糊,部分缺失;5、shANXA3-2组较shControl组HUVECs分布散乱、血管形成能力减弱（P=0.0309）;6、shANXA3-2组总凋亡率和早中期凋亡率明显高于shControl组（P=0.0269,P=0.0243）;而晚期凋亡间无统计学差异（P=0.1885）;7、Cisplatin和5-fluorouracil处理细胞后,shANXA3-1和shANXA3-2组IC50值明显高于shControl组（P=0.0056、P=0.0114,P=0.0456、P=0.0023）;8、与shControl组相比,shANXA3-1和shANXA3-2组顺铂和5-fluorouracil诱导的凋亡现象不明显,耐受性增强;Cisplatin作用下,shANXA3-2组的总凋亡率和早中期凋亡率均小于shControl组（P=0.0060,P=0.0111）,而晚期凋亡间无统计学差异（P=0.317）;9、ANXA3 33-kDa下调调控ERK、PI3K/Akt和内源性凋亡途径等通路中相关蛋白表达水平;10、shANXA3-2组裸鼠移植瘤比shControl组生长较慢、瘤轻;11、shANXA3-2组裸鼠移植瘤中ANXA3、Ki-67和Bcl-2表达均明显低于shControl组,Bax在shControl和shANXA3-2两组中的表达无明显差异。结论:1、成功构建p GPU6/GFP/Neo-shAnxa3和p GPU6/GFP/Neo-shControl真核表达载体,获得了2株ANXA3 33-kDa稳定下调的单克隆HepG2细胞株;2、ANXA3 33-kDa下调抑制HepG2体外增殖、克隆形成、血管形成以及迁移侵袭能力,促其凋亡,增强其对cisplatin和5-fluorouracil的耐药性;3、ANXA3 33-kDa通过ERK和PI3K/Akt通路调控HepG2恶性表型,通过内源性凋亡途径增强HepG2对顺铂耐药性;4、ANXA3 33-kDa下调通过调控细胞增殖和凋亡抑制HepG2裸鼠移植瘤生长。