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第一部分LncRNA NR028的筛选、验证以及肿瘤相关巨噬细胞的诱导目的:将THP-1细胞诱导成M0、M2和类M2型巨噬细胞（Similar M2,SM2）,并验证分子标志物的表达水平。筛选M0和M2型巨噬细胞中差异表达的lncRNA,确定巨噬细胞相关lncRNA。方法:1.应用RT-qPCR方法检测M0、M2和类M2型巨噬细胞分子标志物的表达水平。2.应用RNA纯化技术提取M0、M2型巨噬细胞RNA,使用lncRNA芯片杂交技术筛选差异表达的lncRNA,并用RT-qPCR进行验证。3.应用Si-RNA敲低技术敲低基因,并用RT-qPCR法验证敲低效率。结果:1.RT-qPCR方法分析结果显示,在THP-1细胞诱导的M2和SM2型巨噬细胞中,M1型分子标志物:INOS、HLA-DRα和TNF-α表达减少（P<0.05）,M2型标志物:CD206、Arg-1、CCL22、CCL3、IL-10和VEGF的表达水平增加（P<0.05）。2.RT-qPCR方法分析结果显示,11条表达上调的LncRNA和12条表达下降的lncRNA中,LncRNA NR028基因表达发生明显改变,与基因芯片筛选结果趋势相符。3.si-RNA敲低基因的效率结果显示,LncRNA NR028敲低效率明显（P<0.05）,故用LncRNA NR028做后续实验。小结:运用THP-1细胞成功构建M0、M2和类M2型巨噬细胞模型,证实M2型标志物CD206、Arg-1、CCl22、CCl3、IL-10和VEGF-C表达升高以及M1型标志物TNF-α、HLA-DRα和INOS表达降低,显示模型构建成功。对M2和M0型巨噬细胞的RNA进行LncRNA芯片杂交,筛选出表达倍数、长度、表达稳定性和组织表达水平都符合的差异基因,并且根据基因敲低效率,最终用LncRNA NR028做后续实验。第二部分 LncRNA NR028在巨噬细胞极化中的作用及机制研究目的:研究LncRNA NR028在M2、类M2型巨噬细胞对胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响,并探讨LncRNA NR028在M2巨噬细胞极化中的作用和机制。方法:1.应用MTS实验、划痕愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验检测M2、SM2型巨噬细胞培养上清液对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。2.应用Si-RNA敲低技术检测敲低LncRNA NR028基因后,用ELISA实验检测M2、SM2型巨噬细胞培养上清液中细胞因子的表达水平。3.应用Transwell迁移实验检测敲低LncRNA NR028基因的M2型巨噬细胞对胃癌细胞迁移能力的影响。4.应用核浆分提和RT-qPCR技术检测LncRNA NR028基因在M2型巨噬细胞细胞核和细胞浆中的分布情况。5.应用FISH技术检测LncRNA NR028基因在M2型巨噬细胞中的定位。6.应用RNA-pulldown和质谱联用技术筛选和鉴定M2巨噬细胞中与LncRNA NR028基因直接相互作用的蛋白,并用RNA-pulldown联合Western blotting技术进行验证。7.应用全基因组测序技术检测敲低LncRNA NR028后,M2型巨噬细胞中mRNA表达谱的改变及其中所涉及的通路。结果:1.MTS方法检测结果显示,培养基加20%M2细胞培养上清组和培养基加20%SM2细胞培养上清组可促进胃癌细胞系BGC-823、AGS、SGC-7901的增殖能力（P<0.05）。划痕愈合实验结果表明,M2型、SM2型巨噬细胞培养上清可促进胃癌细胞系BGC-823、AGS、SGC-7901体外迁移能力（P<0.05）。Transwell小室实验结果表明,用培养基加20%M2细胞培养上清组和培养基加20%SM2细胞培养上清组与胃癌细胞系共培养,可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力（P<0.05）。2.ELISA实验结果显示,敲低LncRNA NR028能够促进M2型、SM2型巨噬细胞培养上清中M1型细胞因子HLA、TNF-α、INOS和IL-12表达（P<0.05）,而M2型细胞因子CD206、VEGF-C、CCL22和IL-10表达降低（P<0.05）,说明LncRNA NR028可能是细胞向M2表型发生极化的重要因素,敲低LncRNA NR028后,巨噬细胞向M1方向分化。3.Transwell小室实验结果表明,敲低LncRNA NR028的M2型巨噬细胞可抑制胃癌细胞BGC-823、AGS和SGC-7901的迁移能力（P<0.05）。4.RT-qPCR方法实验结果表明,LncRNA NR028大部分定位在M2型巨噬细胞的细胞核（P<0.05）。5.FISH实验结果表明,LncRNA NR028特异性探针大部分定位在细胞核中,在M2型巨噬细胞中敲低LncRNA NR028表达后,细胞核中的荧光强度减弱,提示LncRNA NR028大部分定位在M2型巨噬细胞的细胞核。6.RNA-pulldown实验联合质谱分析结果显示,根据评分筛选出目的蛋白为CHI3L1和ARG1,用于后续研究。7.全基因组测序结果显示,敲低LncRNA NR028表达后可影响多条细胞信号通路及生物学功能,后续实验选择NF-κB通路进行验证。小结:M2、SM2型巨噬细胞可在体外为胃癌细胞BGC-823、AGS和SGC-7901提供肿瘤赖以生存的微环境,可促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭等能力。敲低LncRNA NR028基因能够抑制胃癌细胞迁移等生物学行为。这些现象可能和LncRNA NR028基因与CHI3L1和ARG1蛋白相互作用有关,为未来的研究提供了思路和方向。第三部分 LncRNA NR028在人胃癌组织细胞中的表达及敲低该基因对裸鼠体内胃癌细胞成瘤能力的研究目的:研究LncRNA NR028在人胃癌组织及癌旁组织TAMs中的表达,分析LncRNA NR028对肿瘤微环境巨噬细胞的影响及对裸鼠体内胃癌细胞转移能力的影响。方法:1.应用RT-qPCR方法检测胃癌组织和癌旁组织TAMs中LncRNA NR028基因的表达。2.构建稳定低表达LncRNA NR028的M2型巨噬细胞,与BGC-823细胞混合进行裸鼠尾静脉注射,观察荷瘤动物体内转移情况。3.应用苏木素-伊红染色检测裸鼠不同脏器中肿瘤细胞的转移情况。结果:1.RT-qPCR方法结果显示,与癌旁组织相比,LncRNA NR028在胃癌组织TAMs中表达显著升高（P<0.05）。2.小鼠活体成像结果显示,敲低LncRNA NR028基因的M2巨噬细胞可降低BGC-823细胞在裸鼠体内的转移能力（P<0.05）。3.苏木素-伊红染色结果表明,M2sh-nc+BGC-823转染组肺组织癌细胞增多,在肝脏、脾脏、肾脏未发现转移的肿瘤细胞。敲低LncRNA NR028基因表达的M2巨噬细胞使胃癌细胞在裸鼠体内的转移能力降低。小结:在人胃癌组织和癌旁组织中分离M2型巨噬细胞,RT-qPCR法检测结果显示LncRNA NR028在胃癌组织中高表达。LncRNA NR028敲低组的胃癌细胞荷瘤裸鼠肺部转移瘤程度和大小明显小于对照组,说明LncRNA NR028不仅体外促进胃癌细胞的增殖,而且在体内也可以促进胃癌细胞的增殖转移,说明LncRNA NR028在胃癌的发生发展过程中起着关键作用。结论:M2型巨噬细胞可调节胃癌细胞在肿瘤微环境中的生长和转移,促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,敲低LncRNA NR028基因后的M2巨噬细胞促进胃癌细胞转移的功能减弱,并可降低肿瘤细胞在裸鼠体内的转移。LncRNA NR028定位在细胞核,可能与ARG1和CHI3L1蛋白结合影响胃癌的进展。