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在免疫反应发生部位，细胞因子微环境对抗原诱导免疫反应的质量和进程起重要作用。细胞因子介导的免疫调节作用可在免疫反应的不同阶段进行，如抗原提呈阶段；特异性免疫反应的效应阶段：免疫记忆反应建立阶段等。利用病毒载体在体内表达细胞因子具有如下优点：可延长细胞因子在体内存在的时间；依赖病毒的组织噬性，可使细胞因子到达特定部位：表达的重组细胞因子可保持更好的生物活性。本研究克隆鸡的白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)和骨髓单核细胞生长因子(MGF)的基因编码区；分别构建表达这3种细胞因子的重组鸡痘病毒(rFPVs)，通过检测它们在体外表达重组细胞因子的生物活性，证明rFPVs可以有效表达鸡IL-1β、IL-2和MGF；以SPF鸡和商品鸡为动物模型，研究rFPVs表达的鸡IL-1β、IL-2、IFN-γ和MGF对新城疫常规疫苗(LaSota)和基因工程疫苗(rFPV-HN)的免疫调节作用，探讨细胞因子发挥免疫佐剂作用的机理，以期开发一种新型的疫苗佐剂。 1 鸡IL-1β、IL-2和MGF基因的克隆及序列分析 在无菌条件下取出4周龄的SPF鸡脾脏，分离单核淋巴细胞，用含有伴刀豆蛋白(ConA)的培养液培养。分别在培养后的8h、24h、48h和72h收集脾淋巴细胞，提取细胞总RNA，分离纯化mRNA。根据GenBank上登录的鸡IL-1β(登录号：Y15006)、IL-2(登录号：AF00631)和MGF(登录号：X14477)cDNA序列，设计扩增鸡IL-1β、IL-2和MGF基因编码区的上、下游引物，在下游引物特异序列的5’端加上痘苗病毒转录终止信号的互补序列(AAA AAA AA)，用RT-PCR方法扩增鸡的IL-1β、IL-2和MGF基因编码区。PCR产物经凝胶电泳分析，扩增出的鸡IL-1β、IL-2和MGF基因编码区片段大小分别为804bp、432bp和606bp，并且发现ConA刺激的脾细胞持续表达IL-1β、IL-2和MGF的时间并扬州大学博士学位论文不相同，其中表达IL一lp持续的时间最长，表达MGF持续时间最短。测得的序列与己发表的序列进行比较，发现鸡IL一1旦有4个核昔酸和1个氨基酸发生了变化，IL一2有4个核昔酸和3个氨基酸发生了变化，而MGF的核昔酸和氨基酸没有发生任何变化。这些位点的变化可能是同一种属不同品种间的正常变化，并不影响其生物活性。2分别表达鸡IL一lp、IL一2和MGF基因重组鸡痘病毒的构建及其表达产物生物活性的检测 将扩增的鸡IL一1旦、IL一2和MGF基因编码区(带有痘苗病毒转录终止信号的互补序列)克隆到鸡痘病毒(FPv)转移载体PI 175中，构建重组质粒pll751LIp、Pll75ILZ和pll75MGF，使鸡IL一1日、IL一2和MGF基因编码区紧处于痘苗病毒早晚期启动子p跳的下游。重组质粒pll75ILI日、pll75ILZ和pll75MGF分别转染己感染FPV疫苗株282E4的鸡胚成纤维细胞中(CEF)，与FPV 282E4株发生同源重组，通过蓝斑筛选和纯化，分别获得表达鸡IL一lp、IL一2和MGF基因的重组鸡痘病毒(rFPVs)rFPV一IL lp、rFPV一ILZ和:FPV一MGF。将获得的rFPVs分别感染单层CEF，72h收获细胞培养上清，经0.1林m滤膜除去其中的:FPvs;利用XTT用MS法检测细胞上清中的重组细胞因子，效价分别为1 .0 xl了U/ml、3.6x IO4uzml、2.1 x lo3U如l，证明吓Pvs可以很好地表达鸡IL一l日、IL一2和MGF。3 rFPvs表达的鸡IL一lp、IL一2、IFN一Y和MGF对新城疫疫苗免疫效力影响 用表达鸡IL一lp、IL一2、IFN一Y和MGF的:FPVs(rFPV一IL lp、rFPV一ILZ、rFPV-IFNY和rFPV一MGF)接种不同日龄的SPF或商品鸡，同时免疫新城疫(ND)Lasota疫苗或基因工程疫苗rFPV.HN，通过检测免疫后的体增重、抗体水平、脾脏中CD矿T细胞和CDS+T细胞数量变化、攻毒后泄殖腔排毒率和保护率等相关免疫指标，比较各组差异，评价细胞因子发挥免疫调节的效果，以期开发安全有效的新型疫苗佐剂。3.1 rFPVs表达的鸡细胞因子抵抗FPV抑制SPF雏鸡体重增长的作用 以SPF鸡为动物模型，FPV疫苗282E4(叭一FPV)可以明显抑制雏鸡早期体重的增长，而:FPV表达的IL一2或IFN一Y可以显著抵抗FPV抑制体重增长:在一定程度上，rFPV表达的IL一lp也表现出相似的作用，而接种表达MGF的:FPV试邵卫星:rFPVs表达的鸡IL一lp、IL一2、IFN一丫或MGF对NO疫苗免疫效力影响川验组鸡的体增重与野生鸡痘病毒(，比.FPV)对照组没有显著性差异。给鸡同时接种表达几一2或IFN一丫的rFPVs，IL一2和IFN一Y不能协同增强抗FPV抑制体重增长。可能是由于该组鸡接种的rFPV量最多，FPV的抑制体重增长的作用超过细胞因子的免疫调节作用。3.2 rFPVs表达的鸡细胞因子对ND疫苗诱导抗体生成的影响 rFPV表达的IL一lp、IL·2或MGF不能显著促进接种Lasota疫苗(1 pDso)的SPF鸡产生抗NDV的HI抗体。用:FPV.HN免疫SPF鸡或NDV母源抗体低的商品鸡，同时接种表达细胞因子的rFPvs，rFPv表达的IL一lp或IFN一丫在免疫后期能促进抗HN间接ELISA抗体的滴度上升，而且产生抗体的整齐度好::FPV表达的IL一2或MGF不能显著促进抗体的生成。联合应用IL一2和IFN一Y的实验组鸡虽然产生抗HN间接ELISA抗体的滴度和整齐度比对照组好，但IL一2和IFN一Y对抗体的产生并没有表现出协同增强作用。33 rFPVs表达的鸡细胞因子对SPF鸡脾脏中CD4+T细胞?