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实体的恶性肿瘤的生长和转移依靠肿瘤新生血管的形成,抗肿瘤血管生成药物早已运用到临床治疗方面。跨膜四家族成员1 (Transmembrane 4 super family,TM4SF1)是TM4SF家族(Tetraspanins)的一个远亲,高表达于多种上皮性肿瘤中,在培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中也高表达。TM4SF1与肿瘤血管的生成密切相关,并被证实其高表达与多种肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移及不良预后正相关。本课题组前期研究已从用卵巢上皮癌患者腹水癌细胞构建的cDNA表达文库中,筛选出相关抗原TM4SF1,发现血清中的TM4SF1自身抗体可作为卵巢上皮癌诊断的血清学指标,且下调TM4SF1的表达,可抑制卵巢上皮癌细胞株HO8910PM的增殖、迁移及转移。本研究通过沉默TM4SF1基因在HUVEC的表达,研究TM4SF1对HUVEC增殖、迁移及血管生成的影响,并将沉默TM4SF1基因的人卵巢癌细胞HO8910PM与HUVEC共接种于裸鼠皮下,利用活体动物成像技术,观察沉默TM4SF1基因后对裸鼠皮下移植瘤的生长、转移及肿瘤血管生成的影响。第一部分慢病毒介导TM4SF1基因沉默的HUVEC及H08910PM稳定株的构建目的利用RNA干扰技术,建立慢病毒介导TM4SF1基因稳定沉默的人脐静脉血管内皮细胞((HUVEC)株及人卵巢癌细胞(HO8910PM)株。方法设计并合成含靶向沉默TM4SF1并同时表达GFP或荧光素酶基因的两种慢病毒载体,并命名为LV-TM4SF1-RNAi-GFP及LV-TM4SF1-RNAi-Luc,将LV-TM4SF1-RNAi-GFP感染高表达TM4SF1的HUVEC,经流式细胞仪筛选出稳定表达的GFP的细胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。将LV-TM4SF1-RNAi-Luc感染高表达TM4SF1的HO8910PM,用嘌呤霉素筛选出稳定表达荧光素酶基因的LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PMo以阴性对照及空白对照为对照,通过RT-PCR及Western blotting技术检测两种稳定株中TM4SF1的基因及蛋白表达。结果成功构建了靶向沉默TM4SF1并同时表达GFP或荧光素酶基因的两种慢病毒载体,感染并筛选出稳定表达细胞株LV-TM4SF1-RNAi-G FP/HUVEC及LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM,与阴性对照LV-CON-R NAi-GFP/HUVEC (LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM )组及HUVEC (HO8 910PM)空白组相比,LV-TM4SF1 -RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SF1-RN Ai- Luc/HO8910PM组TM4SF1 mRNA表达显著下降,为[(0.06±0.02) vs (0.95±0.13)/(1.02±0.13), P<0.05] ([(0.05±0.02) vs (0.91±0.13)/(1.04±0.13), P<0.05]);蛋白表达亦明显降低[(0.13±0.01) vs (0.75± 0.03)/(0.75±0.04), P<0.05](0.11±0.01) vs (0.58±0.02)/(0.65±0.03), P<0.05]),而阴性对照]LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC (LV-CON-RNAi--Luc/HO89 10PM)组及HUVEC (HO8910PM)空白组差别无统计学意义,P均大于0.05。结论利用RNA干扰技术构建出稳定沉默TM4SF1的LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SFl-RNAi-Luc/HO8910PM细胞株。第二部分TM4SF1基因沉默对血管内皮细胞生物学行为影响的体外研究目的 探讨TM4SF1基因沉默对HUVEC的增殖、周期、迁移及血管生成的影响。方法 实验分3组：HUVEC空白组,LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM组及LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC组。应用CCK-8法检测细胞增殖能力的变化,FCM检测细胞周期的变化,Transwell小室检测细胞迁移能力的改变,基质胶成管实验检测细胞血管生成能力的改变。结果TM4SF1基因沉默后,HUVEC增殖活性受抑制[72h时OD值：(0.59±0.06) vs (0.98±0.04)/(1.05±0.05), P<0.05];细胞被阻滞在G0/G1期[(69.30±5.48) vs (54.44±4.09)/(51.69±4.16), P<0.05];迁移能力明显降低[(14.20±4.59) vs (70.60±17.75)/(74.40±16.06), P<0.05];管腔样结构明显减少[(3.33±1.52) vs(19.66±1.52)/(22.66±2.08), P<0.05]。而HUVEC空白组与LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM组差别无统计学意义。结论 沉默TM4SF1基因使HUVEC的增殖、迁移及血管生成能力均受抑制。第三部分TM4SF1基因沉默对卵巢癌肿瘤血管形成影响的体内研究目的构建适用于小动物活体成像系统观察的裸鼠皮下移植瘤模型,探讨TM4SF1基因沉默对卵巢癌肿瘤生长、转移及血管生成的影响。方法用transwell小室共培养HO8910PM及HUVEC细胞,确定两种细胞体外最适合生长比例。再按已确定的细胞比例将稳定沉默TM4SF1的HUVEC及HO8910PM细胞株共接种于裸鼠皮下,构建适用于小动物活体成像系统观察的裸鼠皮下移植瘤模型。将36只雌性裸鼠随机分为6组,分别为A: LV-CON-RNAi-Luc / HO8910PM; B: LV-TM4SFl-RNAi-Luc / HO8910PM; C: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM + LV-CON1-RNA i-GFP/ HUVEC; D: LV-CON-RNAi-Luc / HO8910PM + LV-TM4SF1-R NAi-GFP/HUVEC, E: LV-TM4SF1-RNAi-Luc / HO8910PM + LV-CON1-RNAi-GFP/HUVEC; F: LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-R NAi-GFP/HUVEC。通过活体成像系统检测肿瘤的生长、转移,通过免疫组化染色技术观察各组移植瘤中肿瘤血管形成的情况。结果transwell小室共培养HO8910PM及HUVEC细胞,确定两种细胞体外最适合生长比例为HO8910PM/HUVEC: 2/1。活体成像系统能够检测体外最小的生物素发光的肿瘤细胞数为102个。36只裸鼠成瘤率100%,6周时共死亡4只。到第6周时,共接种HUVEC组(C、D、E、 F)移植瘤体积明显大于单接种HO8910PM组(A、B)。B组移植瘤体积明显小于阴性对照组A[(0.11±0.05)vs(0.87±0.05), P<0.05]; D、E、F组移植瘤体积也不同程度的小于阴性对照组C[(0.26±0.06)/ (0.23±0.07)/(0.04±0.03)vs(0.72±0.08),P均<0.05],共接种组中完全沉默组F移植瘤最小,部分沉默组D与E相当。活体成像系统下观察移植瘤的动态生长情况,随着时间的延长,生物发光荧光信号逐渐增强,但6组均未检测到转移瘤,解剖裸鼠未见腹腔各脏器种植及转移瘤。采用RT-PCR及Western blotting方法验证移植瘤TM4SF1的基因和蛋白沉默效果,沉默组明显低于对照组,与体外细胞实验一致。免疫组化染色技术观察得出,共接种HO8910PM和HUVEC组(C、D、E、F)的微血管数明显高于单接种HO8910PM组(A、B),但仅在共接种组中见到人源化的微血管。单接种组中,对照组(6.67±1.53)与沉默组(6.33±±0.57)微血管数差别无统计学意义(P>0.05)。共接种组中人源化微血管数占总微血管数90%以上。从总微血管数来看,C组(60.67±5.77)和E组(60.33±±9.07)微血管数明显多于D组(36.35±6.42)和F组(31.56±6.11)(P均<0.05),而C组和E组、D组和F组之间微血管数无明显差异(P均>0.05)。结论TM4SF1基因沉默使卵巢癌的体内生长及肿瘤血管形成起到明显的抑制作用,但尚不能确定是否抑制卵巢癌的转移。