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微生物催化法生产丙烯酰胺具有反应条件温和、选择性高、产品纯度高和收率高等优点。微生物菌种腈水合酶的合成能力是影响丙烯酰胺生产水平和经济效益的关键因素。本文从采集土样中分离到一株能利用丙烯腈生产丙烯酰胺的菌株,采用16S rRNA等现代分类技术并结合生理生化实验等经典分类技术对该菌株进行了分类鉴定。同时还研究了该菌株产酶条件和丙烯酰胺转化条件。
通过对长期被腈化物污染的土壤中的微生物富集培养和筛选,得到一株具有腈水合酶活力为428U/mL的菌株ZH8,且该菌株表现出较强的底物耐受性。通过形态观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列分析和BIOLOG系统鉴定方法,该菌株鉴定为红球菌属(Rhodococcus)菌种,命名为Rhodococcus sp.ZH8。
建立了Rhodococcus sp.ZH8的产酶条件,发酵培养基:葡萄糖15g/L、酵母粉5g/L、尿素7g/L、Co2+10 × 10-5mol/L、KH2PO40.5g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、谷氨酸钠1g/L;培养条件:种龄25h、接种量6%、培养温度28℃、转速180r/min。菌体培养60h后酶活达到了855U/mL。
Rhodococcus sp.ZH8的生长过程表明培养液pH,残余葡萄糖含量、细胞密度与酶活之间存在相关性。优化后产酶条件:培养液pH维持在7.0左右、菌体培养24h后添加的尿素为9g/L,培养周期为72h,发酵结束后酶活达到了4628U/mL。
根据丙烯酰胺转化条件对丙烯酰胺生成率的影响,确定最佳的丙烯酰胺转化条件:28℃、pH 7.0的50mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液、20%的丙烯腈。底物浓度为20%时,丙烯酰胺生成率达100%。