研究背景脑卒中是目前最为常见的心脑血管疾病之一。主要分为出血性脑卒中(Hemorrhagic stroke)和缺血性脑卒中(Ischemic stroke)。现有的治疗手段还存在一些局限性,如组织纤溶酶原激活剂仅用于急性期治疗,传统的中草药存在毒副作用。传统观念认为,神经细胞死亡会引起不可逆的脑损伤。但近年研究发现,脑损伤会刺激成年哺乳动物中枢神经系统的神经再生与修复,并持续数月时间,这使得在脑卒中的慢性期寻找有效的药物治疗显得尤为重要。如果选用可行的方法刺激内源性神经干细胞的神经再生,使其向缺血半影区迁移并分化,产生新的神经元代替凋亡细胞,可以达到神经修复的作用。神经组织工程的三要素:支架材料,神经营养因子,种子细胞,在再生医学领域起着重要的作用。水凝胶早在1993年被Zhang等首次提出,因其具有良好的组织相容性,可以模拟细胞三维生长环境,成为优良的支架材料。在1999年该研究团队报道了 RADA16-I,在适宜的条件下可以引发其自组装,形成三维立体网状结构,有利于细胞的黏附和生长。CDNF于2007年被Lindholm等人发现,其含有187个氨基酸,并具有两个独特的结构域。CDNF作为一种新型的神经营养因子,可以为神经细胞提供营养,并对神经元的生长起重要作用。大量文献报道了 CDNF对于帕金森疾病的有效治疗及良好的神经修复作用。神经干细胞作为种子细胞的一种,因为其具有迁移性、分化性、免疫原性、来源广泛等特点,成为研究中枢神经系统的重要细胞。在脑缺血再灌注损伤中,需要寻找有效方法刺激神经再生和提高神经保护。已有文献报道了 RADA16-I水凝胶对喉返神经(RLNs)再生有效。CDNF在PD模型中可以减少中脑多巴胺能神经元受损,另外CDNF可以通过减少脑缺血损伤神经元内质网应激来达到神经保护作用。这些结果提示RADA16-I和CDNF具有促进神经再生和神经保护的作用,但是在脑缺血再灌注损伤模型中,两者是否对神经再生和神经保护有作用尚未见报道。本课题将利用神经组织工程,通过脑立体定位仪在侧脑室(LV)显微注射支架材料RADA16-I和神经营养因子CDNF,探究两者对神经干细胞各种特性的影响,并运用神经生物学、分子生物学、细胞生物学及动物行为学等技术研究其神经再生和神经保护作用及机制。研究目的1、RADA16-I及CDNF在脑缺血再灌注损伤中对神经再生的作用。2、RADA16-I及CDNF对体外培养神经干细胞增殖分化的作用。3、RADA16-I及CDNF对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。4、CDNF在脑缺血再灌注损伤中对神经再生和神经保护的作用分子机制研究。研究方法1、建立大鼠脑缺血再灌注模型采用改良的线栓法制备右脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血2 h后拔出栓线实现脑缺血再灌注。2、大鼠脑内定位注射RADA16-I及CDNF腹腔注射10%水合氯醛,待大鼠无翻正反射后,固定于脑立体定位仪上。调整耳棒及大鼠头部高低,使前囟点和人字点Z值之差不超过0.05。然后调整定位针至前囟点,将X、Y、Z数值归零,作为参考零点。将定位针移动至指定位置并标记,颅钻打孔。将无菌蒸馏水、10μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6μg CDNF,分别注射到大鼠脑内侧脑室中。3、BrdU腹腔注射和免疫荧光组织化学染色大鼠建立脑缺血再灌注模型,缺血2 h/再灌注70 h后给药,并按大鼠体重50 mg/kg的剂量,连续7天腹腔注射浓度为10 mg/mL的5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)。给药后第11天或第25天,对大鼠进行心脏灌流取脑。取出的鼠脑放在4%PFA溶液中固定24 h后,用10%、20%、30%的蔗糖溶液脱水。最后进行冰冻切片将组织切成40 μm的薄片,并取特定位置脑片进行免疫荧光染色实验。抗体来源属性和使用浓度分别为:BrdU(Sheep,1:500),nestin(Ms,1:500),DCX(Rb,1:500),NeuN(Ms,1:250),GFAP(Rb,1:500),Caspase-3(Rb,1:500)。4、TTC染色及缺血梗死体积计算将大鼠断头,用刀片将大脑切成2 mm的脑片,放入提前配制好的2%TTC(1×PBS作为溶剂)溶液中。并置于37℃烘箱中孵育30 min。用扫描仪扫描正反面并保存图片,用Photoshop分析缺血梗死体积。缺血梗死体积百分比=(白色梗死面积×厚度)/(全层面积×厚度)× 100%。5、组织蛋白提取和SDS聚丙烯凝胶电泳选取大鼠SVZ脑区及缺血半影区的组织,研磨并裂解组织以提取蛋白。通过免疫印迹的方法来检测通路中相关蛋白的表达情况。6、神经功能缺陷评分根据Longa和Bederon的五分制的方法,在脑缺血再灌注24 h后,对大鼠进行神经功能缺陷评分。无神经功能损伤,记为0分;手术对侧前肢不能完全伸展,记为1分;向手术对侧转圈,记为2分;向手术对侧倾倒,记为3分;丧失意识,不能自主行走,记为4分。后续实验选择1～2分的大鼠。7、原代神经干细胞培养取怀孕SD大鼠第13.5天的胚胎前脑组织,消化成单细胞,加入适量神经干细胞培养基种植于6 cm皿中,置于培养箱中培养。每3天进行一次换液,每5天进行一次传代。8、神经干细胞增殖及分化检测将3000个左右的细胞接种于24孔板每个孔中,分为四组,在实验第5天进行细胞球拍照,统计各组数量及直径。体外培养5天的神经球接种于24孔板中,分为四组并加入神经干细胞分化培养基进行诱导分化,培养第7天进行免疫荧光染色。抗体来源属性和使用浓度分别为:GFAP(Rb,1:300),Tuj1(Ms,1:200)。实验结果1、RADA16-I及CDNF在脑缺血再灌注损伤中对神经再生的作用1.1在侧脑室注射RADA16-I及CDNF重组蛋白,可以促进SVZ脑区细胞的增殖建立大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为四组,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10 μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6 μg CDNF。给药后第11天,对大鼠进行心脏灌流取脑。制作冰冻切片,选取SVZ脑区进行BrdU与nestin、BrdU与DCX免疫荧光组织化学双重染色。结果发现,RADA16-I,CDNF,RADA16-I+CDNF三组均比CON组显著增加新生神经干细胞及新生神经祖细胞的数量。1.2在侧脑室注射RADA16-I及CDNF重组蛋白,可以促进细胞向缺血半影区的迁移建立大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为四组,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6 μg CDNF。给药后第11天,对大鼠进行心脏灌流取脑。制作冰冻切片,选取缺血半影区进行BrdU与DCX共染。结果发现,RADA16-I,CDNF,RADA16-I+CDNF三组均比CON组明显促进细胞向缺血半影区的迁移。1.3在侧脑室注射RADA16-I,可以促进神经干细胞向神经元的分化建立大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为四组,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10 μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6 μg CDNF。给药后第11天,对大鼠进行心脏灌流取脑。制作冰冻切片,选取缺血半影区进行BrdU与NeuN共染。结果发现,与CON组相比,注射RADA16-I可以显著增加神经元的数量。1.4在侧脑室注射RADA16-I及CDNF重组蛋白,可以促进神经干细胞向神经元的分化建立大鼠脑缺血再灌注模型,随机分为四组,缺血2h/再灌注70h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10 μg RADA16-I、6μg CDNF、10μgRADA16-I+6μg CDNF。给药后第25天,对大鼠进行心脏灌流取脑。制作冰冻切片,选取缺血半影区进行BrdU与GFAP、BrdU与NeuN共染。结果发现,在缺血半影区,与CON组相比,RADA16-I,CDNF,RADA16-I+CDNF三组对星形胶质细胞的数量无显著影响,但三组均可以显著增加神经元的数量。2、RADA16-I及CDNF对体外培养神经干细胞增殖和分化的作用2.1 RADA16-I及CDNF重组蛋白可以促进体外培养的神经干细胞的增殖取怀孕SD大鼠第13.5天的胚胎前脑组织,消化成单细胞,24孔板每个孔接种3000个左右的细胞。加入神经干细胞培养基培养,第5天在倒置显微镜下对每个孔中的细胞球进行拍照。统计直径在50～200 nm之间的神经球数量及直径。结果发现,RADA16-I,CDNF,RADA16-I+CDNF三组中的细胞球数量及直径均比CON组明显增加。2.2 RADA16-I及CDNF重组蛋白可以促进体外培养的神经干细胞的分化取怀孕SD大鼠第13.5天的胚胎前脑组织,消化成单细胞,加入神经干细胞培养基培养5天后,将细胞球接种在24孔板中(24孔板提前加入飞片和水凝胶)。加入神经干细胞分化培养基进行诱导分化,培养第7天进行免疫荧光染色观察。结果发现,RADA16-I,CDNF,RADA16-I+CDNF三组中星形胶质细胞及神经元的比例显著高于对照组。3、RADA16-I及CDNF在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用3.1 CDNF能够促进脑缺血再灌注损伤的神经功能修复建立大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2h/再灌注70h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6μg CDNF。在给药后第0、1、2、3天,根据Longa和Bederon的五分制的方法对大鼠进行神经功能缺陷评分。给药后1天发现,RADA16-I组和CON组相比无显著差异;CDNF、RADA 16-I+CDNF两组比CON组明显降低神经功能缺陷评分,且两组之间没有明显差异。3.2 CDNF能够减少脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积建立大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10 μg RADA16-I、6 μg CDNF、10 μg RADA16-I+6μg CDNF。给药后第4天,将大鼠断头,进行TTC染色。用Photoshop分析梗死体积,梗死体积百分比=(白色梗死面积×厚度)/(全层面积×厚度)×100%。统计发现,RADA16-I组和CON组相比无显著差异;CDNF、RAD A16-I+CDNF两组比CON组明显降低梗死体积百分比,且两组之间没有明显差异。3.3 CDNF能够减少缺血半影区神经细胞的凋亡建立大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立立体定位仪在侧脑室分别注射无菌蒸馏水、10μg RADA16-I、6μg CDNF、10μg RADA16-I+6μg CDNF。给药后第11天,对大鼠进行心脏灌流取脑。制作冰冻切片,选取缺血半影区进行Caspase3染色。结果发现,RADA16-I组和CON组相比无显著差异;与CON组相比,CDNF,RADA16-I+CDNF两组均可以明显减少缺血半影区Caspase3阳性细胞的数量。4、CDNF在脑缺血损伤中神经再生和神经保护作用的潜在分子机制为了探讨CDNF参与脑缺血再灌注损伤神经再生和神经保护作用的分子机制,建立大鼠脑缺血再灌注模型,缺血2 h/再灌注70 h后,通过脑立体定位仪在侧脑室注射CDNF,给药后第1 1天取大鼠缺血侧SVZ和缺血半影区的组织并裂解提取蛋白。通过SDS聚丙烯凝胶电泳检测ERK及STAT3通路中的相关蛋白。统计发现,CDNF使SVZ区域的p-STAT3的表达水平明显降低。此外CDNF使缺血半影区的p-ERK水平明显升高,p-STAT3的表达水平明显降低。由此说明CDNF参与脑缺血再灌注损伤中的神经再生过程主要是通过STAT3信号通路实现的,而神经保护需要ERK及STAT3通路的参与。实验结论1、RADA16-I及CDNF能够促进脑缺血再灌注损伤中SVZ脑区的神经再生。2、RADA16-I及CDNF重组蛋白可以促进体外培养神经干细胞的增殖和分化。3、CDNF在脑缺血再灌注损伤中可以起到神经保护的作用。4、CDNF可能通过ERK及STAT3信号通路调控脑缺血后的神经再生和神经保护。创新点1、RADA16-I及CDNF具有促进脑缺血再灌注损伤中的神经再生作用。2、RADA16-I及CDNF具有促进体外培养神经干细胞的增殖分化作用。3、CDNF在脑缺血再灌注损伤中调控神经再生和神经保护作用的潜在分子机制。