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肝细胞癌HCC是一个全球性的健康问题,位于全球癌症致死率第四位。我国2018年肝癌发病率排名世界第九,每100,000人中就有超过13.4人患肝癌。每年投入到肝癌治疗的人力物力不计其数,是巨大的全民健康负担,然而对于肝癌的诊断和治疗尚没有一个较为优势的方式。庆幸的是,近年来肝癌的免疫疗法逐渐显现出一定的可能性。肝癌存在多种信号通路以及有潜力的分子靶点,因此有较多分子靶向类药物目前正在进行临床研究。磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)是其中一个非常有潜力的分子靶点,其在非恶性组织中几乎检测不到,而在肝癌组织中高度表达,因此这使其成为一个特异性较高的肝癌诊断和治疗潜在靶标。嵌合抗原受体T细胞疗法是近几年以来较为热门的肿瘤个性化治疗方式。与其他免疫治疗相似,CAR-T疗法的主要思路是突破肿瘤微环境,使机体自身的T淋巴细胞发挥对肿瘤组织的杀伤作用,以此来达到治疗的目的。在恶性血液瘤的治疗中取得了很好的效果,并且最近在实体瘤的治疗方面也开始出现突破。本研究利用慢病毒感染系统,通过对CAR基因组件和慢病毒感染条件进行了摸索,获得了最佳的CAR构建以及慢病毒感染条件,借此工程性地改造了人原代T淋巴细胞,使其稳定表达GPC3特异性的CAR。初步建立了CAR-T构建平台,得到了在GPC3阳性肿瘤细胞存在的情况下能够有效激活地GPC3特异性CAR-T细胞,并且其能有效地分泌细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ,均与对照组存在明显差异。有效的T细胞激活和细胞因子释放,是T细胞突破肿瘤微环境,对肿瘤组织进行杀伤的前提。GPC3特异性CAR-T细胞针对Huh7、HepG2、Hep3B等六株肝癌细胞株都表现出较好的体外杀伤活性,E:T(Effector:Target)为10:1时,针对所有的肝癌细胞株在第四天基本都能达到最大杀伤效率95%以上。体外抗肿瘤活性表现优异,体内肿瘤抑制能力同样表现出色。我们在SCID小鼠背部皮下预先对Huh7细胞进行成瘤,并通过五针三组不同剂量CAR-T细胞的注射对CAR-T的治疗剂量进行了摸索,确定2.5×106的CAR-T细胞为最终的治疗剂量。在正式体内实验时,我们同样预先在SCID小鼠皮下成瘤,接瘤24 d后挑选出肿瘤大小75-100 mm3的小鼠,分为2.5×106 Anti-GPC3-CAR-T治疗组和PBS对照组。每两天治疗一针,一共治疗四针,通过观察肿瘤的生长趋势,可以看到GPC3特异性CAR-T细胞表现出明显的体内肿瘤抑制效果。最后一天对照组小鼠平均肿瘤体积大小是CAR-T治疗组的1.8倍。最后,本研究初步评估了GPC3特异性CAR-T的安全性和特异性,通过对治疗组和对照组的小鼠进行解剖,获取肝、肺、脾、瘤进行免疫组化检测T细胞靶标CD8和肝癌靶标GPC3。从实验结果来看,其他GPC3阴性组织中无法检测出T细胞的信号,说明GPC3特异性CAR-T细胞能够较为特异地靶向GPC3阳性的肿瘤组织,具备一定的特异性和安全性。综上所述,本研究成功完成了C AR-T构建平台地初步摸索,获得了体外激活和细胞因子分泌都表现不错的GPC3特异性的CAR-T细胞,同时验证了其体外的肿瘤细胞杀伤活性和体内肿瘤抑制能力,并且初步评价了其特异性和安全性。给肝癌的免疫治疗研究鉴定了基础,也为其他类型的肿瘤治疗研究搭建了新的平台。