氧是生命存在的必要条件，是机体新陈代谢和维持生存的重要因素之一，而低氧是生命发育的基本环境。在妊娠的早期，由于没有血管的形成，所以胚胎是在低氧环境中发育的。低氧作为一种生理性的刺激因素，影响着胚胎的发生、发育及正常功能的维持。低氧可激活低氧诱导因子（HIF-1），从而调控一系列与缺氧相关基因的表达。例如，诱导与葡萄糖分解、转运、红细胞和血管再生等相关的基因，使其表达增加，从而维持体内氧环境的稳态。关于低氧作用的研究，目前多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面，而对低氧在细胞增殖、分化中影响的研究较少。特别是胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）体外培养和增殖分化作用的研究都是在常氧（20％O₂）条件下进行的，这样难以反映体内的真实情况。低氧在体内作为一种生理性的刺激因素，对体外培养的ES细胞增殖和分化的作用目前还不清楚，也没有引起科研人员的足够重视。因此，本文就低氧对ES细胞体外增殖和分化作用的影响进行了初步研究。 1．低氧对ES细胞体外增殖的作用 利用细胞记数法和BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入的流式细胞分析检 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响测低氧对ES细胞的增殖作用，并用RT一PCR和western一B10t蛋白印迹杂交的方法初步检测了ES细胞中低氧诱导因子一l（HIF一la）的表达变化。结果显示:（l）将ES细胞分别放在低氧（3%02和10%仇）和常氧（20%02）的环境中培养24小时后，在低氧环境中培养的ES细胞数较常氧组明显减少。（2）将ES细胞分别给予间歇性低氧刺激（3% 02和10%02），每天10分钟，连续4天后，发现3%低氧组较常氧对照组的细胞增殖明显升高。（3）我们又进一步用RT一PCR方法观察HIF一IQmRNA的表达与细胞增殖的关系，发现在常氧环境中培养的ES细胞即有H工F一IQmRNA的表达，ES细胞在持续低氧24小时或间歇性低氧（3%02和10%02）刺激4天后对HIF一la的表达均无明显影响。（4）western一Blot蛋白印迹杂交结果表明:持续低氧和间歇性低氧后，常氧组与低氧组间HIF一IQ蛋白表达量无明显差异。2.维甲酸（RA）诱导ES细胞向神经细胞方向分化的方法建立 常规培养的ES细胞，以3x105/ml的密度接种于细菌培养皿，在含20%胎牛血清的分化培养基中即可自然分化形成拟胚体（Embryonicbody，EB）。EB经RA的诱导向神经细胞方向分化。本研究中，我们主要采用了自然分化的EB形成4天后，加入RA（终浓度为 5X10一7M）诱导4天，即4d+4dRA诱导分化的方法，诱导结束后，收集EB，单细胞接种于涂l%明胶的细胞培养皿中。然后换成无血清DMEM/F12高糖培养基，同时添加终浓度为2%的NZ神经营养因子培养。结果显示:（l）4d+4dRA方法可诱导出nestin阳性的神经前体细胞，且分化率达90%以上。（2）4d+4dRA方法可诱导出较多NeuN免疫反应阳性的神经元样细胞。3.低氧对EB的形成及向神经前体细胞方向分化的影响 ES细胞常规培养液中撤除白血病抑制因子（LIF）和脱离饲养层培养，即可自然分化为EB。我们选择5x104/ml接种ES细胞于细菌培养皿，使之自然分化形成EB，并给予持续性低氧（3%02）4天后，EB 硕士学位论文低氧对胚胎干细胞体外增殖和分化的影响形成较常氧组减少，且低氧组EB数随低氧培养时间的延长而逐渐降低，即低氧组12天时形成的EB数少于8天时，低氧8天时则少于4天时。 为了观察低氧对体外诱导ES细胞向神经前体细胞分化过程的影响，我们用nestin标记流式细胞方法检测ES细胞向神经前体细胞的分化情况。常规培养的ES细胞以3x105/ml密度接种于6Omm细菌培养皿，培养4天形成EB，第五天开始分组，即RA组;低氧组;低氧加RA诱导组。RA组:ES自然分化形成EB4天后，再加5 X10一，M RA诱导4天;低氧组:ES自然分化形成EB4天后，再给予持续低氧条件培养4天;低氧加RA诱导组:ES自然分化形成EB4天后，再同时给予持续低氧条件和添加sxlo一7MRA诱导培养4天。流式细胞检测结果表明低氧促进体外诱导ES细胞向神经前体细胞的分化，细胞免疫组化结果进一步加以证实了此现象。 综上所述，低氧对ES细胞体外增殖和分化均有影响。就本实验而言，持续性低氧抑制ES细胞的体外增殖，而间隙性低氧（3%02）可促进ES细胞的体外增殖;持续性低氧或间歇性低氧后，ES细胞内HIF一1 a mRNA表达都无明显变化;持续性低氧和间歇性低氧后，低氧和常氧组间无明显差异;低氧（3%02）抑制ES细胞体外自然分化形成EB;单纯低氧（3%02）抑制ES细胞体外分化为nestin染色阳性的神经前体细胞;而低氧（3%02）并同时添加RA诱导分化组与单纯RA诱导分化组比较，则促进其向nestin染色阳性神经前体细胞的分化。