肺癌目前仍然是一个严重的公众健康问题,并且占全世界癌症死亡原因的第一位,其中所有阶段的五年存活率非小细胞肺癌为14-17%,小细胞肺癌仅为6%。临床和流行病学研究表明肺部的慢性感染,慢性炎症与肺癌之间有着非常密切的关联。在慢性感染和慢性炎症中免疫系统在维持组织平衡,细胞代谢,组织重构,以及防止感染和细胞转化等过程中起着至关重要的作用。在肿瘤发展过程中包括很多不同的炎性组分,这些组分可以释放多种细胞因子,趋化因子及细胞毒性介质,成为促进炎性肿瘤发生、发展的关键因素。如活性氧(ROS),金属蛋白酶,白细胞介素,和干扰素等。癌症相关炎症影响到恶性肿瘤的许多方面,其中包括增殖和恶性细胞的存活,肿瘤血管生成,恶性肿瘤转移,以及肿瘤对化疗药物和激素的敏感性。肺癌是目前最常诊断的肿瘤,居男性癌症相关死亡的主要原因,女性癌症相关死亡原因的第二位。无论在发达国家还是发展中国家,乳腺癌和肺癌分别是在女性和男性中最常见的恶行肿瘤和癌症死亡的首要原因。观察肺癌在不同国家的发生及变化趋势或者是每个国家的男女性之间发生比率可以看出与烟草的使用频率有非常密切的关系。有学者统计,大约有20%的肿瘤与慢性感染有关,30%与吸烟及吸入污染物(例如二氧化硅和石棉)有关,35%与饮食因素有关(其中20%的肿瘤负荷与肥胖相关)。现在的研究发现,一氧化氮合成酶(NOS)在肿瘤的发生过程中有着重要的意义。首先发现的第一种一氧化氮合成酶(NOS)是从大脑神经组织中纯化出来的,命名为神经元型NOS或Ⅰ型NOS(nNOS或NOS-1)；随后发现了诱导型NOS,称为二型NOS(iNOS或NOS-2)；后来又发现了内皮型或Ⅲ型NOS(eNOS或NOS-3)。这三种不同类型的一氧化氮合成酶的基因分别位于三个不同的染色体。其中NOS2可以通过诱导产生,如脂多糖(LPS)或许多促炎细胞因子(IL-1,IFNγ, TNFa),并在体内迅速表达,产生大量的一氧化氮,并广泛分布在不同类型的细胞中。过多的一氧化氮对促进肿瘤细胞增殖有重要的意义,并且在许多病理状态下也会促进一氧化氮的产生,例如(1)组织急性损伤和各种炎症性疾病(2)神经系统疾病(3)的自身免疫性疾病(4)血管生成及相关疾病(5)糖尿病。iNOS最先在小鼠的巨噬细胞中被分离出来。巨噬细胞产生通过诱导型一氧化氮合成酶可以产生一氧化氮及活性氧,继而产生过氧阴离子对体内的微生物起杀伤作用。但是过量的一氧化氮,活性氧和过氧阴离子可以增加机体的氧化应激和组织损伤,可以造成机体慢性炎症的病理状态。在一些慢性炎症性疾病中,巨噬细胞被认为是诱发肿瘤的危险因素之一。在肺自发性鳞状细胞癌的小鼠模型(Lori-IKKaK44A/K44A)中发现,IKKa激酶失活,IKKa水平下调对小鼠肺鳞癌的发生有重要的促进作用,在研究中发现其肺部鳞状细胞癌的发生率与肺部的肿瘤微环境有密切的关系,在肿瘤组织及近端癌旁组织中发现了iNOS及炎性细胞因子及趋化因子表达增高。这也与人类的发病状况相似。同时该研究中通过剔除巨噬细胞发现可以降低肺肿瘤组织中的炎性细胞因子明显降低。为了进一步观察iNOS在肺鳞状细胞癌中的重要作用。我们在这个动物模型的基础上通过基因杂交技术将小鼠的iNOS基因敲除(iNOS-/-),观察小鼠肿瘤的发生率影响及iNOS对肿瘤的治疗作用。研究目的：通过iNOS基因敲除小鼠观察iNOS信号通路在肺鳞状细胞癌发生发展过程中的重要作用,探讨iNOS在人肺鳞状细胞癌中治疗意义。研究对象：本研究中所有小鼠均按照美国国立卫生研究院(NIH)动物管理与应用委员会(IACUC)制定的指南为原则,在相对无菌洁净的动物房中饲养。通过基因杂交技术以FVB小鼠为基础杂交L-IKKaK44A/K44A小鼠与L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠。以第七代至第九代小鼠为观察对象,分成WT、L-IKKΩK44A/K44A、L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-三组,每组选取50只为观察对象,其中18只持续每天观察小鼠的活动状态,进食状况,皮肤毛发的脱落情况,呼吸频率及呼吸困难的程度,发现异常及时进行无痛处死,留取肺脏、脾脏组织。研究方法：1.通过聚合酶链式反应筛选所需基因型的小鼠,包括Loricrin基因阳性,IKKαK44A/K44A及NOS2-/-基因突变纯合子的小鼠。根据需要保留杂合子小鼠用于传代。2.荧光实时定量聚合酶链式反应(qPCR)。用TRIzol溶液提取组织及细胞中的RNA,用Tetro cDNA Synthesis Kit(BIOLINE,USA)试剂盒进行逆转录,然后检测三组小鼠肺脏组织中IL4,IL5,IL10,IL17a的RNA水平,每组实验重复3次。同时用Real-time PCR for RT2 Profiler PCR-array检测三组小鼠肺脏及CD4+T淋巴细胞的细胞因子及趋化因子的变化趋势。3.用流式细胞仪分离提取脾脏CD4+T细胞。每组选取6-8周龄小鼠3-5只,通过PE CD4, APC-Cy7 CD8,及7ADD标记脾脏细胞,分离提取出CD4阳性的T淋巴细胞,提取RNA后检测细胞因子水平。4.用流式细胞仪检测小鼠肺脏中的巨噬细胞和淋巴细胞的数量。每组选取10-12周龄小鼠3-5只,孵育肺脏细胞。单个核细胞标记抗体：FITC CD45, PE CDllc, PE-Cy7 CD11b, APC F4/80,APC-Cy7 MHCII,700 GR1。淋巴细胞标记抗体FITC CD45, PE CD4, PE-Cy7 B220, APC CD3,APC-Cy7CD8。实验重复3次。5.用免疫杂交印记分析(Western blot)的方法检测小鼠肺脏组织中Trim29,环氧化酶-2(COX-2)的变化,每组小鼠选取5月龄,3只,实验重复3次。检测小鼠巨噬细胞中iNOS及Argeanse-1的变化,每组小鼠选取6-8周,3只,重复3次。6.小鼠骨髓移植。选取6-8周龄的三组小鼠,每组5只,接受γ射线照射后进行骨髓移植。供体为12周L-IKKαK44A/K44A, L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-两组小鼠。移植前1周和移植后2周受体小鼠接受含有抗生素的水喂食。接受移植后2个月处死小鼠观察小鼠的肺部肿瘤发生率。7.用8-0H-DG对小鼠肺组织进行免疫荧光染色。分别选取6月龄的小鼠的肺脏组织切片进行免疫荧光染色,每组3只,观察肺脏细胞中DNA损伤的变化。8.统计学方法：所有实验数据输入GraphPad Prism5制图统计软件,以均数士标准差表示,组间采用t-TEST进行统计学分析,p<0.05认为差异具有统计学意义。研究结果：1.在持续观察的18只小鼠中,FVB作为阴性对照均可健康成活一年。L-IKKαK44A/K44A组中的小鼠在六个月时有15只小鼠,肉眼均可见肺部肿瘤,病理学切片显示均为肺鳞状细胞癌,其余3只在7-10个月时陆续死亡,病理结果也均为肺鳞状细胞癌。L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-组中在6个月时12只小鼠中有1只死亡,肉眼可见肺部肿瘤,病理结果为鳞癌,其余11只处死后,其中1例病理学结果显示肺鳞癌,剩余6只持续观察,小鼠伴有部分皮肤炎症的表型,但都可以存活至12个月,处死后肉眼及病理学切片均未发现肺部肿瘤。因此我们将WT、Lori-IKKαK44A/K44A、Lori- IKKα K44A/K44ANOS2-/-三组进行比较。通过三组小鼠组织病理学切片HE染色对比发现,Lori-IKKαK44A/L44ANOS2-/-组较Lori-IKKαK44A/K44A组肺组织炎性浸润明显减少,用免疫组化和流式细胞仪检测三组小鼠肺内巨噬细胞的数量,结果显示Lori-IKKαK44A/K44ANOS2-/-组较Lori-IKKαK44A/K44A组肺脏巨噬细胞数量明显减少,p<0.001,有显著地统计学意义。2.为了证实iNOS在骨髓中的作用,我们分别用L-IKKαK44A/K44A和L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠的骨髓,移植到三组小鼠体内,2个月后观察小鼠肿瘤的发生情况。结果显示无论是受体或供体,存在iNOS-/-的小鼠肺部肿瘤的发生率都较iNOS+/+有明显的降低,而且在巨噬细胞中表现的更加明显,说明iNOS不仅可以在组织上皮细胞中可以抑制肿瘤细胞的生长,而且在巨噬细胞中对肿瘤生长抑制过程起着更加重要的作用。3.免疫杂交印记实验结果显示,实验组较阳性对照组小鼠肺脏Trim29和COX2的表达都有显著的下降,说明在iNOS-/-小鼠体内氧化应激水平下降,可以减少细胞的DNA损伤,同时8-OH-DG的免疫荧光染色也进一步证实了该项结果。4.用Real-time PCR的方法检测小鼠肺脏及T淋巴细胞的炎症性因子的变化,结果显示实验组较阳性对照组IL5,IL17a均降低,p<0.05,有统计学意义。结论：1) iNOS在肺鳞状细胞癌及其周围微环境中的表达明显增高,同时iNOS可以趋化巨噬细胞向肿瘤及肿瘤周围组织聚集,加重肿瘤炎症环境的加重,从而促进肿瘤的生长。2) 通过NOS2-/-小鼠观察到,iNOS水平降低可以明显的降低肿瘤的发生率、延长小鼠的生存期。3) 通过骨髓移植实验证明了,iNOS不仅可以作用于组织的上皮细胞,而且可以通过作用于骨髓减少巨噬细胞的产生,抑制肺鳞状细胞癌的发生。4)iNOS-/-可以减轻机体的炎性反应,降低机体的氧化应激,减少DNA损伤,抑制细胞向肿瘤细胞转化,从而降低肿瘤的发生。