论文部分内容阅读
β地中海贫血(简称β-地贫)是由于β珠蛋白合成减少或者缺乏而引起的最常见的遗传性血液病,而β珠蛋白第2内含子的第654位碱基C→T突变(IVS-2-654 C→T,简称β654)则是导致中国人β-地贫最常见的突变类型之一。到目前为止,β-地贫尚缺乏有效的根治方法,造血干细胞移植是目前挽救β-地贫患者生命最有希望的治疗途径。然而出生后造血干细胞移植面临的最大困难是移植免疫排斥反应的发生,因此造血干细胞移植的应用仍然受到相当的限制。
近年来的研究表明,克服移植免疫排斥反应的一种有效途径是进行宫内造血干细胞移植(In utero hematopoietic stem celltransplantation,IUHSCT),即在妊娠早中期胎儿免疫系统发育不成熟时,将外源的造血干细胞输入到胎儿体内,使植入的干细胞在受体中归巢并增殖分化,从而发挥治疗疾病的作用。
为了使干细胞宫内移植能应用到临床实践,首先需在动物体内进行宫内治疗的实验研究,通过建立干细胞嵌合体动物模型来探讨干细胞在体内的各种生物学特征和功能,为宫内治疗的实施奠定理论和技术基础。本课题利用一种β654地中海贫血(简称β654地贫)模型小鼠,通过宫内移植造血干细胞的方式来建立稳定的同种异体/异种异体嵌合模型,系统应用分子遗传学、血液学和细胞生物学等方法观察植入的外源干细胞治疗地贫小鼠的效果。
为了提高小鼠宫内移植的效率,本研究首先对宫内移植的方法进行了改进,减少了对胎鼠的损伤,缩短了宫内移植手术的时间。与过去沿用的方法相比,改进后孕鼠的产仔率(34％vs.60％)和嵌合率(29％vs.53％)显著提高(P<0.05)。运用改进后的移植方法,首次将孕鼠宫内移植的时间提前到了孕12.5天；并且取得了较高的嵌合率(73％)。宫内移植方法的改进,为进一步开展β654地中海贫血小鼠的宫内治疗奠定了基础。
然后,我们利用免疫磁珠方法分离和富集转GFP因小鼠的骨髓Sca-1+造血干细胞(HSC),以β654地贫小鼠作为受体,将此细胞注入胎鼠的腹腔,建立了同种异体的宫内移植小鼠模型。出生的β654地贫受体小鼠经聚合酶链反应(PCR)检测供体细胞中特异的GFP和HS2序列,证实其均为嵌合体小鼠(嵌合率为100％)；移植组出生的小鼠中β654小鼠的阳性率为46％,显著高于对照组(25％,P<0.05)。通过流式细胞仪(FACS)和荧光显微镜的检测,在嵌合小鼠的外周血中观察到有表达GFP的供体红细胞出现；以供体的GFP序列为探针作间期荧光原位杂交实验(FISH)分析,结果显示嵌合小鼠的骨髓中存在有供体的GFP阳性细胞。为了观察IUHSCT对β654地贫小鼠的治疗作用,我们定期检测了嵌合β654地贫小鼠的血液学指标。经过分析发现,与对照组相比,移植了HSC的β654地贫小鼠外周血中,血红蛋白水平(7.9±0.4 vs.10.5±0.4 g/dl)和红细胞水平(5.9±0.4 vs.7.5±0.3106/μl)均有显著的升高(P<0.05),外周血中异型红细胞和靶型细胞的比例显著下降(40.1±4.1 vs.24.5±3.9％,P<0.05),网织红细胞数目减少(281.2±8.3 vs.180.3±6.9‰,P<0.05)；我们进一步观察了HSC移植后嵌合β654地贫小鼠脾脏的体积和重量以及髓外造血的情况,结果发现移植后小鼠的脾脏体积减小,重量减轻。对脾脏和肝脏的组织病理学分析显示,移植后小鼠的红髓范围减少,髓外造血减轻；肝脏中铁离子沉积减少；骨髓中的有核细胞比例也显著降低。以上结果表明供体细胞能在受体小鼠体内分化扩增并改善贫血症状。
在同种异体模型的基础上,以人脐血来源的造血干细胞为供体,进一步建立了异种异体的人/鼠嵌合β654小鼠模型,每隔四周通过FACS和PCR检测β654地贫小鼠体内的人源细胞,结果显示出生的β654小鼠中均有人源细胞的存在。在出生后的移植组小鼠中β654小鼠的阳性率为44％,显著高于对照组的23％(P<0.05)。双色FISH实验结果显示,在宫内移植的嵌合小鼠骨髓中有人特异的17号染色体微卫星序列的杂交信号,说明存在人源细胞。我们通过RT-PCR、Western Blotting和ELISA等方法,检测到在嵌合小鼠外周血中有正常剪接的人β珠蛋白mRNA和蛋白质的表达。进一步分析发现嵌合小鼠的血液学指标得到不同程度的改善,异型红细胞、靶型细胞和网织红细胞的比例下降；髓外造血减轻,在脾脏病理切片中,红髓减少,原始的造血细胞和含铁血黄素沉积减少；肝脏中血窦分布和铁离子沉积减少。本研究结果提示在β-地贫小鼠的体内环境中,移植人脐血来源的造血干细胞能够向受体小鼠的骨髓中归巢,并向红系分化扩增,从而改善β654地贫小鼠的贫血症状,为临床前的研究提供了更多的信息。
本课题利用一种β654地贫模型小鼠,通过宫内移植造血干细胞的方式建立了稳定的同种异体/异种异体嵌合模型,植入的外源干细胞能够长期纠正β654地贫小鼠的贫血症状,为了解干细胞移植后的体内行为,探讨宫内治疗的可行性和广泛开展的可能性提供了重要的实验数据；也为遗传性疾病的宫内治疗提供了新的思路和方法,具有极其重要的临床应用前景。
近年来的研究表明,克服移植免疫排斥反应的一种有效途径是进行宫内造血干细胞移植(In utero hematopoietic stem celltransplantation,IUHSCT),即在妊娠早中期胎儿免疫系统发育不成熟时,将外源的造血干细胞输入到胎儿体内,使植入的干细胞在受体中归巢并增殖分化,从而发挥治疗疾病的作用。
为了使干细胞宫内移植能应用到临床实践,首先需在动物体内进行宫内治疗的实验研究,通过建立干细胞嵌合体动物模型来探讨干细胞在体内的各种生物学特征和功能,为宫内治疗的实施奠定理论和技术基础。本课题利用一种β654地中海贫血(简称β654地贫)模型小鼠,通过宫内移植造血干细胞的方式来建立稳定的同种异体/异种异体嵌合模型,系统应用分子遗传学、血液学和细胞生物学等方法观察植入的外源干细胞治疗地贫小鼠的效果。
为了提高小鼠宫内移植的效率,本研究首先对宫内移植的方法进行了改进,减少了对胎鼠的损伤,缩短了宫内移植手术的时间。与过去沿用的方法相比,改进后孕鼠的产仔率(34％vs.60％)和嵌合率(29％vs.53％)显著提高(P<0.05)。运用改进后的移植方法,首次将孕鼠宫内移植的时间提前到了孕12.5天；并且取得了较高的嵌合率(73％)。宫内移植方法的改进,为进一步开展β654地中海贫血小鼠的宫内治疗奠定了基础。
然后,我们利用免疫磁珠方法分离和富集转GFP因小鼠的骨髓Sca-1+造血干细胞(HSC),以β654地贫小鼠作为受体,将此细胞注入胎鼠的腹腔,建立了同种异体的宫内移植小鼠模型。出生的β654地贫受体小鼠经聚合酶链反应(PCR)检测供体细胞中特异的GFP和HS2序列,证实其均为嵌合体小鼠(嵌合率为100％)；移植组出生的小鼠中β654小鼠的阳性率为46％,显著高于对照组(25％,P<0.05)。通过流式细胞仪(FACS)和荧光显微镜的检测,在嵌合小鼠的外周血中观察到有表达GFP的供体红细胞出现；以供体的GFP序列为探针作间期荧光原位杂交实验(FISH)分析,结果显示嵌合小鼠的骨髓中存在有供体的GFP阳性细胞。为了观察IUHSCT对β654地贫小鼠的治疗作用,我们定期检测了嵌合β654地贫小鼠的血液学指标。经过分析发现,与对照组相比,移植了HSC的β654地贫小鼠外周血中,血红蛋白水平(7.9±0.4 vs.10.5±0.4 g/dl)和红细胞水平(5.9±0.4 vs.7.5±0.3106/μl)均有显著的升高(P<0.05),外周血中异型红细胞和靶型细胞的比例显著下降(40.1±4.1 vs.24.5±3.9％,P<0.05),网织红细胞数目减少(281.2±8.3 vs.180.3±6.9‰,P<0.05)；我们进一步观察了HSC移植后嵌合β654地贫小鼠脾脏的体积和重量以及髓外造血的情况,结果发现移植后小鼠的脾脏体积减小,重量减轻。对脾脏和肝脏的组织病理学分析显示,移植后小鼠的红髓范围减少,髓外造血减轻；肝脏中铁离子沉积减少；骨髓中的有核细胞比例也显著降低。以上结果表明供体细胞能在受体小鼠体内分化扩增并改善贫血症状。
在同种异体模型的基础上,以人脐血来源的造血干细胞为供体,进一步建立了异种异体的人/鼠嵌合β654小鼠模型,每隔四周通过FACS和PCR检测β654地贫小鼠体内的人源细胞,结果显示出生的β654小鼠中均有人源细胞的存在。在出生后的移植组小鼠中β654小鼠的阳性率为44％,显著高于对照组的23％(P<0.05)。双色FISH实验结果显示,在宫内移植的嵌合小鼠骨髓中有人特异的17号染色体微卫星序列的杂交信号,说明存在人源细胞。我们通过RT-PCR、Western Blotting和ELISA等方法,检测到在嵌合小鼠外周血中有正常剪接的人β珠蛋白mRNA和蛋白质的表达。进一步分析发现嵌合小鼠的血液学指标得到不同程度的改善,异型红细胞、靶型细胞和网织红细胞的比例下降；髓外造血减轻,在脾脏病理切片中,红髓减少,原始的造血细胞和含铁血黄素沉积减少；肝脏中血窦分布和铁离子沉积减少。本研究结果提示在β-地贫小鼠的体内环境中,移植人脐血来源的造血干细胞能够向受体小鼠的骨髓中归巢,并向红系分化扩增,从而改善β654地贫小鼠的贫血症状,为临床前的研究提供了更多的信息。
本课题利用一种β654地贫模型小鼠,通过宫内移植造血干细胞的方式建立了稳定的同种异体/异种异体嵌合模型,植入的外源干细胞能够长期纠正β654地贫小鼠的贫血症状,为了解干细胞移植后的体内行为,探讨宫内治疗的可行性和广泛开展的可能性提供了重要的实验数据；也为遗传性疾病的宫内治疗提供了新的思路和方法,具有极其重要的临床应用前景。