急性心肌梗死、脑梗死、肺梗塞、外周动脉血栓和深部静脉血栓等心脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，全世界每年大约有1200万人死于心脑血管疾病。心血管类疾病给人类的健康构成了严重的威胁。血栓的形成多发生于心、脑血管，是一种死亡率极高的心血管疾病。因此，研制和生产高效的溶解血栓药物，已成为临床的迫切要求。 reteplase是第三代溶血栓药物，该产品不但生产工艺简单，在临床上更具有药物半衰期长、溶栓作用强、副作用小等优点。 本实验室已成功将reteplase基因连接在载体pET22b上，并转到宿主BL21(DE3)，构建成工程菌pTPAa<，3>/BL21，在IPTG的诱导下，目的蛋白以包涵体的形式表达。包涵体己经被广泛的用作相对纯的，尽管错误折叠的肽链需要通过复性来获得有生物活性的可溶蛋白。以包涵体形式表达蛋白有其明显优点。包涵体蛋白表达量高，而且抵御蛋白酶的水解。当目的产物对宿主有毒性或致死性，那么包涵体的表达将是最可行方法。 我们对reteplase的表达条件进行优化，在5L的发酵罐中，当发酵培养基为Tryptone 10 g/L，Yeast reextract powder 5g/L,NaCl 10 g/L，Na<,2>HPO<,4>.12H<,2>O6g/L，KH<,2>PO<,4>3 g/L，MgSO<,4>·7H<,2>O 1 g/L，G1ucose 5 g/L时，发酵罐培养时控制pH值7.2，37℃培养，发酵开始的时间3h控制溶氧100％,以后的时间将溶氧控制在40％。补料用的200,g/L Tryptone溶液在3h后开始连续流加350ml。D<,600>值达到20时加入IPTG，IPTG终浓度为80μM，诱导4h，葡萄糖浓度控制在0.1g/L，诱导后温度为40℃时，OD<,600>值达到了70，包涵体蛋白为3g/L。 本研究应用了三种原理不同的方法对reteplase进行体外复性。1、传统的稀释复性。在复性缓冲液中加入GsH/GssG对，促进二硫键的形成，并添加L-精氨酸来抑制聚集。2、二硫键异构酶(PDI)辅助复性。3、色谱法辅助复性。主要利用改良的分子排阻凝胶色谱辅助复性。三种方法优化后的复性率分别为296、13.2％、9.2％。本研究将ETI-Sepharose4B亲和层析柱，用来纯化reteplase。刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂类，而Reteplase是精氨酸特征性的丝氨酸蛋白酶，它能被ETI作用点上的Arg63识别并产生可逆性结合：据此可以用ETI作为亲和填料来纯化reteplase。并与Sepharose 4B偶联，制成ETI-Sepharose4B亲和层析柱，得到很好的纯化效果，纯度在90％。 将reteplase基因亚克隆到PET32a(+)质粒载体上，将其转入到BL21(DE3)中，实现了硫氧还蛋白Trx与reteplase的融合表达，融合蛋白部分以可溶的形式存在，用镍柱纯化后，可溶蛋白的浓度为0.2mg/ml，但比活仅为1000IU/mg，说明并非所有可溶蛋白都正确折叠，其原因在于硫氧还蛋白Trx在细胞质中主要以还原状态存在，不能提供足够的氧化还原力使reteplase正确折叠。