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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性寄生于几乎所有有核细胞内的寄生性原虫。弓形虫中间宿主广泛，感染宿主后可致弓形虫病，是重要的人畜共患病原。目前治疗弓形虫的药物都存在副作用强的缺陷且不能完全杀灭虫体。寻找一种高效、低毒抗弓形虫药物是弓形虫病防治工作中亟需解决的问题。 自噬相关蛋白8（autophagy-related protein8, Atg8）是真核生物自噬途径中参与自噬体形成的必需的泛素样蛋白。Atg8-Atg3蛋白相互作用是调控Atg8-PE复合物、自噬体形成的关键步骤。阻断两个蛋白的相互作用已经证实可以抑制病毒、疟原虫的复制，是一种具有研发前景的药物靶点。小分子抑制剂因其具有膜通透性好、特异性高、对宿主细胞毒性小的优点已进入临床II期研发阶段。本课题组前期已经证实弓形虫自噬相关蛋白（TgAtg）8与TgAtg3之间存在特异的蛋白-蛋白相互作用关系，且两者以1:1的比例发生结合，并对TgAtg8-TgAtg3相互作用的分子机制进行了初步的研究，然而对虫株体内两者相互作用机制还未进行深入验证。 基于前期的实验结果，本研究分为两个部分： ①利用构建成功的GFP-TgAtg8R27E过表达虫株进行GFP-pulldown实验验证在虫株体内TgAtg8蛋白第27位Arg氨基酸在介导TgAtg8-TgAtg3蛋白与蛋白相互作用的功能，通过表达TgAtg3点突变蛋白进行体内、外实验，确定TgAtg3中的AIM序列（Atg8蛋白相互作用基序，Atg8-interacting motif）； ②以TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用为靶点，筛选抑制弓形虫增殖的小分子抑制剂。 目的： 1. 明确TgAtg8蛋白第27位Arg氨基酸在介导TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用中的作用。 2. 确定TgAtg3蛋白中的AIM序列。 3. 以TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用为靶点，筛选获得能够显著抑制弓形虫增殖的小分子药物。 方法： 1. 刚地弓形虫TgAtg8-TgAtg3蛋白-蛋白相互作用分子机制的研究 1.1. RH GFP-TgAtg8R27E点突变过表达虫株GFP-pulldown实验 分别提取RH GFP-TgAtg8与RH GFP-TgAtg8R27E过表达虫株总蛋白，与GFP-beads孵育后，收集洗脱液进行Western blot验证并用ImageJ软件分析灰度值，检测GFP-TgAtg8R27E点突变蛋白与TgAtg3蛋白的结合力。 1.2. 重组蛋白HIS-TgAtg3W168A/P171A GST-pulldown实验 利用重叠PCR诱导定点突变的方法构建HIS-TgAtg3W168A/P171A原核表达质粒，纯化构建成功质粒的蛋白，并纯化HIS-TgAtg3蛋白和GST-TgAtg8蛋白进行GST-pulldown实验，收集洗脱液进行Western Blot验证并用ImageJ软件分析灰度值，观察与分析HIS-TgAtg3W168A/P171A与TgAtg8蛋白的结合能力。 1.3. 重组蛋白HIS-TgAtg3、HIS-TgAtg3F239A/I242A与弓形虫总蛋白HIS-pulldown实验 纯化HIS-TgAtg3、HIS-TgAtg3F239A/I242A重组蛋白，并提取RH△HX虫株总蛋白，将等量的HIS-TgAtg3、HIS-TgAtg3F239A/I242A重组蛋白分别与虫株总蛋白孵育4 h，并其混合液加入至已装好镍的预装柱中结合1 h，用100 mM的咪唑进行洗脱，收集洗脱液进行进行Western blot验证并用ImageJ软件分析灰度值，观察与分析HIS-TgAtg3F239A/I242A与内源性TgAtg8的结合能力。 1.4. 重 组 蛋 白 HIS-TgAtg3F239A 、 HIS-TgAtg3I242A 、 HIS-TgAtg3F239A/I242A GST-pulldown实验 纯化HIS-TgAtg3、HIS-TgAtg3F239A、HIS-TgAtg3I242A、HIS-TgAtg3F239A/I242A重组蛋白进行GST-pulldown实验，Western Blot验证后用ImageJ软件进行灰度值比较。 2. TgAtg8-TgAtg3蛋白-蛋白相互作用为靶点小分子抑制剂的筛选 2.1. AlphaScreen小分子抑制剂筛选实验 纯化HIS-TgAtg3和GST-TgAtg8蛋白，生物素标记GST-TgAtg8蛋白，将两种蛋白混合加入384孔板，随后加入1751个小分子化合物，再加入受体磁珠共同孵育，1 h后测定384孔板每个孔的信号并根据信号的强弱筛选小分子药物。 2.2.细胞水平筛选小分子化合物 利用空斑实验对上部分筛选出的小分子药物进行进一步筛选，得到明显抑制弓形虫增殖的小分子化合物，并通过B1基因荧光定量qPCR实验测定抑制弓形虫增殖的EC 50值（抑制50%虫体增殖的效应浓度），结合CCK 8实验最终筛得对宿主细胞无毒副作用的抗弓形虫药物。 2.3.小分子化合物表型评价实验 首先利用 AlphaScreen 实验评价筛选得到的两个小分子药物体外抑制TgAtg8-TgAtg3结合的IC 50值（抑制50%的TgAtg8-TgAtg3相互作用的药物浓度），通过用小分子药物作用虫体增殖的不同阶段，确定小分子药物抑制了弓形虫过程中的入侵，胞内增殖还是出胞阶段。 2.4.明确小分子药物对虫体内TgAtg8-TgAtg3蛋白-蛋白相互作用及顶质体的影响 荧光显微镜下观察用小分子药物作用的饥饿诱导的GFP-TgAtg8虫株自噬标志物Atg8-PE复合物的形成情况并用Western Blot进行进一步验证。观察药物作用后虫株顶质体形态的变化并通过进行ycf 24基因（单拷贝顶质体基因）及uprt基因（单拷贝核基因）荧光定量qPCR实验对顶质体复制情况进行监测。对药物作用的 GFP-TgAtg8 虫株进行 GFP-pulldown 实验，评价小分子药物对TgAtg8-TgAtg3蛋白-蛋白相互作用。 2.5.评价小分子药物对弓形虫感染小鼠模型的体内效应 将BALB/C小鼠随机分组，组别为A-K组（5只/组），用刚出胞的RH△HX虫株对相应组别小鼠进行感染，每只小鼠感染虫株数量为1000个/只，一天后，对感染虫株的各组小鼠连续灌胃给药五天，密切观察各组小鼠状态并记录生存时间。 结果： 1. ImageJ软件分析Western Blot结果中GFP与TgAtg3条带的灰度值后，比较分析结果可知：与野生GFP-TgAtg8虫株相比较，GFP-TgAtg8R27E虫株与TgAtg3蛋白的结合能力显著下降。 2. Western blot结果表明HIS-TgAtg3w168A/P171A重组蛋白表达成功，ImageJ软件分析HIS-TgAtg3w168A/P171A GST-pulldown实验，结果显示：与HIS-TgAtg3野生蛋白相比，HIS-TgAtg3w168A/P171A蛋白与GST-TgAtg8结合的能力没有明显差异。 3. ImageJ软件分析Western blot结果中HIS-TgAtg3与TgAtg8的灰度值后，与HIS-TgAtg3野生蛋白相比，HIS-TgAtg3F239A/I242A与内源性TgAtg8的结合能力明显下降。 4. ImageJ软件分析Western blot结果中HIS-TgAtg3与GST-TgAtg8灰度值后，与对照组 HIS-TgAtg3 蛋白相比， HIS-TgAtg3F239A、HIS-TgAtg3I242A、HIS-TgAtg3F239A/I242A蛋白与GST-TgAtg8蛋白结合的能力都显著下降。 5. AlphaScreen小分子抑制剂筛选实验中通过比较AlphaScreen信号的强弱，初步筛选得到18个小分子抑制剂和1个小分子促进剂，并通过重复实验和反筛查实验最终获得11个小分子抑制剂和1个小分子促进剂。 6. 通过对上部分筛选出的6个小分子抑制剂和1个小分子促进剂进行细胞水平的实验，利用空斑实验最终得到两个明显抑制弓形虫增殖又对宿主细胞无明显毒副作用的小分子化合物，并通过B1基因荧光定量qPCR实验确定Compound 4和Compound 6小分子药物抑制虫体增殖的EC 50值分别为：2.27μM和1.13μM，CCK 8结果显示Compound 4和Compound 6小分子药物抑制细胞增殖的IC50值（抑制50%细胞增殖的效应浓度）分别为：34.35μM和7.216μM。Compound 4的化学名称为GSK J4 HCL，Compound 6的化学名称为NVP-AEW541。 7. AlphaScreen实验结果显示GSK J4 HCL和NVP-AEW541在蛋白水平上抑制和促进TgAtg8-TgAtg3相互作用的IC 50值和EC 50值分别为11.01μM和5.298μM。对这两个小分子抑制剂进行的表型评价结果表明GSK J4 HCL和NVP-AEW541分别影响了虫株的胞内增殖阶段和入侵阶段。 8. 对两种药物的作用机制进行初步验证发现，两种药物对顶质体的数量及形态都没有影响且对不影响内源性TgAtg8-TgAtg3蛋白相互作用。 9. 动物实验表明与对照组相比，乙胺嘧啶组生存时间明显延长，GSK J4 HCL组和NVP-AEW541组小鼠的生存时间略有延长，但差异无统计学意义。 结论： 虫株体内TgAtg8第27位Arg氨基酸是介导TgAtg8-TgAtg3蛋白与蛋白相互作用的保守性氨基酸位点。TgAtg3中FADI序列是介导TgAtg8蛋白结合的唯一AIM序列，并且证实TgAtg3第239位苯丙氨酸（Phe）和第242位异亮氨酸（Ile）会影响TgAtg3与内源性TgAtg8的结合。筛选获得了两个明显抑制弓形虫增殖的抗弓形虫药物，分别影响了虫株的胞内增殖和入侵。