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摘要：基因治疗是恶性肿瘤等重大疾病治疗的最新策略,基因载体是基因治疗的关键技术之一,但现有的病毒型载体安全性和非病毒型载体低效率严重制约了其临床应用。羟基磷灰石(HAP)是人体骨骼的主要成分,具有天然的生物相容性,与蛋白和基因有高亲和性,且HAP纳米颗粒本身对癌细胞具有抑制性能。前期研究显示HAP纳米颗粒是一种极具应用潜力的基因载体材料,但需要进一步提高其基因转染效能,并阐明其细胞转导机制及其与载体微结构之间的关系。本论文选择了一种水热合成法制备的稀土金属掺杂的精氨酸表面修饰羟基磷灰石(HAP/Arg)纳米颗粒为研究对象,阐明HAP/Arg纳米颗粒的基因负载与释放机理,并将其作用于体外培养的人正常血管内皮细胞和人肿瘤细胞Hela细胞,考察HAP/Arg纳米颗粒的负载基因的转染活性和生物安全性,实时观察HAP/Arg纳米颗粒的跨膜转运入胞过程,并阐释与细胞相互作用的入胞机制。主要内容及结论归纳如下：1)以HAP纳米颗粒液相可控合成及其功能化研究为基础,水热法制备了结晶程度比较高、晶形完整的HAP/Arg纳米颗粒。研究发现,精氨酸修饰的HAP纳米颗粒与没添加精氨酸合成的HAP纳米颗粒在结构上基本一致。但精氨酸的加入在一定程度上抑制了HAP纳米颗粒的生长速率,与没添加精氨酸合成的HAP纳米颗粒相比,其长径比有所减小,呈短棒状,表面电荷由荷负电转为荷正电。从而为提高HAP纳米颗粒的基因转染效能奠定了基础。其次,少量稀土离子Eu或Tb掺杂不影响合成的HAP/Arg纳米颗粒产物的结构,均为单一的HAP纳米颗粒物相,在相应可见光波段范围内均有发射特征峰,激发后分别可发出较强的特征红光和绿光,从而使HAP/Arg纳米颗粒具有发射荧光性能。2)阐明了HAP/Arg纳米颗粒的基因负载与释放机理。结果表明,荷正电的HAP/Arg纳米颗粒与带负电荷的质粒DNA通过静电结合能快速形成HAP/Arg-DNA复合物,且30μg的HAP/Arg纳米颗粒至少能结合1μg DNA。同时,HAP/Arg纳米颗粒对结合的DNA有明显的保护作用,可免受人体血浆蛋白成分或核酸酶的破坏,从而提高了其转载DNA的体内稳定性,为体内基因转染创造了良好条件。3)考察了HAP/Arg纳米颗粒的体外细胞转染活性和生物安全性。研究发现,HAP/Arg-DNA复合物可以有效转染Hela细胞,而未经精氨酸修饰的HAP纳米颗粒不能有效转载质粒DNA,对Hela细胞的转染效率极低。HAP/Arg纳米颗粒各剂量组在不同作用时间下对所选择的人正常血管内皮细胞(HAEC)和人肿瘤细胞(Hela)的正常生长和细胞膜结构均无明显影响。动物的急性毒性实验和生殖毒性实验表明,HAP/Arg纳米颗粒各剂量组与对照组相比均无显著差异。以上结果为下一步构建一种能高效、安全、简便的新型纳米基因转导系统打下基础。4)实时观察HAP/Arg纳米颗粒的跨膜转运入胞过程,并阐释了其内吞入胞作用机制。研究表明,铽掺杂的HAP/Arg纳米颗粒被人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)摄取后主要存在于细胞质中,而且大部分分布在细胞核区域周围。并且,HAP/Arg纳米颗粒的入胞过程具有时间和浓度依赖性,作用时间以4h为宜,纳米颗粒的浓度以50μg/mL为最佳。入胞竞争实验结果也表明精氨酸修饰的HAP纳米颗粒入胞量明显强于未经精氨酸修饰的HAP纳米颗粒,这很可能与精氨酸及其胍基官能团的作用有关。内吞抑制试验结果表明HAP/Arg纳米颗粒进入HUVEC细胞是一个主动转运的能量依赖的过程,并为网格蛋白和小凹蛋白介导内吞相结合的细胞跨膜转运机制,但以小凹蛋白介导内吞途径为主。