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目的:胃癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤,胃癌早期无特异性症状,多数病例发现后已是中晚期,常于短期内死亡,目前虽然胃癌的治疗方法较多,但除早期胃癌可以手术切除治愈外,其他如放疗,化疗等的疗效均不能令人满意。基因治疗的出现,给肿瘤治疗提供了新的治疗方向。Akt是PI3K/Akt生存信号传导通路的一个关键因子,通过磷酸化一系列的下游底物,调节细胞的生长、生存、增殖、侵袭、凋亡等生物学活性,Akt的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。为了明确Akt1在胃癌发病中的作用,为胃癌的基因治疗提供新的靶基因,进行了本项研究。方法:本课题重点研究了胃癌中Akt1通路的异常表达,应用RNA干涉技术干预该通路的异常激活对胃癌恶性表型的影响。课题分三部分进行:第一部分:采用55例胃腺癌标本制成的组织芯片,通过免疫组织化学法检测胃腺癌、癌旁及胃的非肿瘤组织中Akt1及通路上相关因子的表达,筛选出了异常表达的MMP2,Ki-67,Bcl-2和PTEN等基因。第二部分:侧重于在体外应用RNA干扰技术以oligofectamine介导靶向Akt1的siRNA转染人胃癌细胞系SGC7901后,应用real time PCR和western blot技术检测了目的基因的敲低情况,并应用western blot和免疫荧光技术检测了敲低Akt1的表达后,Akt1通路相关因子的表达变化,并用流式细胞术、matrigel 2D,3D实验、transwell实验、划痕实验、MTT法等方法分析了转染前后肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭、凋亡等生物学活性的变化。第三部分:体内试验则通过建立裸鼠皮下胃癌动物模型,瘤内注射oligofectamine和siRNA的混合物,动态观察肿瘤生长情况,检测RNA干扰技术敲低Akt1表达后SGC7901裸鼠模型中Akt1通路相关因子的表达变化,并用TUNEL原位凋亡的方法检测细胞凋亡,进一步验证了体外研究的结果。结果:第一部分:结果显示,Akt1,MMP2,Ki-67,Bcl-2在胃癌中的表达明显高于癌旁组织及非肿瘤组织,且肿瘤的分化越差,表达越高,而PTEN的表达则与之相反。第二部分:Real time PCR及western blot的结果均显示,与control和nonsense-siRNA组比较,转染Akt1-siRNA组中Akt1的表达下降(P＜0.05),通过westernblot和免疫荧光检测发现除Akt1表达下调外,此通路上的相关因子表达均下降,流式细胞术结果显示,转染Akt1-siRNA组凋亡的细胞明显增多(P＜0.05),检测细胞周期分布发现S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1期,MTT结果显示,转染Akt1-siRNA组细胞的增殖率明显受到抑制(P＜0.05),matrigel实验及transwell实验结果均提示,转染Akt1-siRNA组细胞的侵袭能力受到了抑制,划痕实验显示细胞的迁移能力降低。第三部分:成功建立SGC7901胃癌细胞系裸鼠皮下肿瘤后,每4天测量一次肿瘤体积,并在肿瘤局部多点注射siRNA和oligofectamine混合物,发现和control组相比,Akt1-siRNA治疗组肿瘤的生长缓慢,应用免疫组化法检测肿瘤标本,发现Akt1蛋白表达降低的同时,此通路上相关基因的表达也下降,应用TUNEL法检测原位细胞凋亡发现,Akt1-siRNA治疗组凋亡的细胞明显增多,体内和体外实验的结果一致。结论:1.胃癌中Akt1异常激活,且Akt通路上的相关基因表达增加,从而导致肿瘤细胞的增殖和侵袭,阻滞了细胞的凋亡。2.应用RNA干涉技术以oligofectamine介导转染靶向Akt1的siRNA可有效敲低目的基因在人胃癌细胞系SGC7901内的表达,同时抑制Akt通路的活性,从而抑制了细胞的增殖和侵袭,出现G0/G1期阻滞,并诱发细胞凋亡。3.裸鼠皮下胃癌动物模型应用oligofectamine介导Akt1-siRNA治疗,同样可有效敲低Akt1的表达,抑制Akt通路的活性,从而抑制肿瘤的生长,诱导细胞凋亡,与体外试验结果一致。4.Akt1可以作为胃癌基因治疗的候选靶基因,且RNA干扰技术是一项有效的基因沉默的新技术,有潜在临床应用前景。