谷胱甘肽S-转移酶(GSTs,EC2.5.1.18)是一种多功能超家族酶类,普遍存在于真核和原核生物体内。GSTs的主要功能是催化谷胱甘肽(GSH)与生物异源性物质进行轭合反应,此外,GSTs还参与生物机体内源性物质的代谢,其具有的硒非依赖性谷胱甘肽过氧化物酶(non-Se GPx)活性,能够保护细胞免受氧化应激损伤。除了具有催化功能之外,GSTs还能够与一些疏水性物质,如药物、激素及一些代谢产物进行直接的螯合作用。根据氨基酸序列的相似性和免疫关系等,将昆虫的胞质型GSTs分为6个已知家族,其中Sigma、Theta、Zeta和Omega四个家族普遍存在于大多数生物体中,而Delta和Epsilon为昆虫所特异的家族,还有一些未被分类的昆虫GSTs被发现。家蚕(Bombyx mori)由野蚕(Bombyx mandarina)驯化而来,作为一种重要的经济昆虫,蚕丝已被开发用于多个领域。同时,作为鳞翅目昆虫的重要模式生物,家蚕被广泛用于昆虫的遗传学和分子生物学研究。近年来,家蚕全基因组测序的完成以及大量功能基因组学数据的公布,家蚕GSTs的全基因组分析鉴定已经完成。本文主要对家蚕GSTs Epsilon家族中的一个能被杀虫剂诱导的基因Bm GSTe2进行了克隆并展开功能研究,所得主要结果如下:1.家蚕Bm GSTe2基因的克隆和序列分析通过RT-PCR从家蚕的中肠组织中克隆得到Bm GSTE2编码基因的全长c DNA,该基因在Gen Bank中的检索号为:DQ355376。Bm GSTe2基因的开放读码框(ORF)全长为648 bp,编码215个氨基酸残基,编码蛋白的分子量为24.72k Da,等电点为5.98。根据氨基酸序列相似性,挑选具有代表性的昆虫GSTs,与Bm GSTE2蛋白构建了系统发生树。结果显示,Bm GSTE2与其他昆虫的Epsilon家族成员聚为一类,表明Bm GSTE2确属于昆虫特异的Epsilon家族。通过结构预测,检测到Bm GSTE2蛋白的三个保守结构域:二聚体界面多肽结合位点,C-末端底物结合位点(H-位点)和N-末端谷胱甘肽结合位点(G-位点)。2.家蚕Bm GSTE2蛋白的异源表达和酶活性测定我们构建了p ET28a-Bm GSTe2原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测,Bm GSTE2蛋白以可溶形式表达。通过离子交换色谱和超滤等方法对重组蛋白进行纯化。纯化后的Bm GSTE2重组蛋白对GSTs模式底物CDNB的活性为5.24μmol/min/mg,对枯稀过氧化氢表现出的non-Se GPx活性为0.10μmol/min/mg。在Bm GSTE2的热稳定性检测实验中,通过对梯度温度孵育后的蛋白进行活性测定,发现Bm GSTE2的酶活性在50°C及以下保持相对稳定。选用两种有机磷杀虫剂(辛硫磷,毒死蜱)和一种拟除虫菊酯类杀虫剂(甲氰菊酯)对Bm GSTE2重组蛋白的酶活性进行抑制性分析,三种抑制剂对Bm GSTE2活性的抑制模式相似,酶活性都是随着抑制剂浓度的升高而降低。辛硫磷和毒死蜱两种有机磷类杀虫剂对Bm GSTE2的酶活性抑制中浓度(IC50)分别为0.15 m M和0.18 m M,相比之下,甲氰菊酯对Bm GSTE2的抑制强度更高,IC50为0.09 m M。3.家蚕Bm GSTE2蛋白的组织分布利用免疫印迹技术检测了Bm GSTE2在蛋白水平的组织分布,通过对家蚕四个重要组织进行检测,发现Bm GSTE2只在家蚕19-440品系5龄3天幼虫的中肠组织中有表达。在实验室条件下,分别用辛硫磷(有机磷类)和甲氰菊酯(拟除虫菊酯类)两种杀虫剂对家蚕(19-440品系)进行连续多代筛选,并用Western blotting检测Bm GSTE2在筛选前后家蚕品系中肠组织中的表达情况。结果表明,Bm GSTE2在辛硫磷和甲氰菊酯筛选后的家蚕中肠组织的表达明显高于未经筛选的对照。因此,经杀虫剂的筛选,家蚕Bm GSTE2出现了过表达。4.家蚕Bm GSTE2蛋白的组织定位实验通过免疫组织化学反应对Bm GSTE2蛋白进行组织定位。由于该蛋白只在中肠组织有表达,所以仅选取中肠组织对目的蛋白做免疫组织化学定位分析。结果表明,Bm GSTE2在家蚕中肠上皮的圆柱形细胞,杯形细胞和再生细胞中均有的表达信号。综上所述,利用辛硫磷和甲氰菊酯连续多代筛选的家蚕为材料,我们克隆了能被杀虫剂诱导的Bm GSTe2基因,该基因为中肠特异表达的基因。外源表达、杀虫剂对酶活性抑制分析、免疫印迹等实验证实Bm GSTE2参与了家蚕幼虫耐药性的形成。对家蚕GSTs的功能性研究,不仅能为培育具有抗药性的家蚕品种奠定基础。同时,作为鳞翅目昆虫的模式生物,对家蚕耐药性GSTs的功能鉴定,将为其他鳞翅目或相关害虫的防治提供靶标。