脓毒症是感染引起的全身炎性反应综合征,作为创伤、烧伤、感染等临床危重患者的严重并发症之一,脓毒症是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsydrome,MODS)的前兆,也是当今危重病医学面临的重大难题。目前普遍认为脓毒症患者病理生理学的变化与革兰阴性菌感染及其裂解产物--内毒素,又称脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)密切相关。LPS进入体内后激活损伤内皮细胞,刺激单核-巨噬细胞,释放出多种氧自由基和炎性介质,引发脓毒症。脓毒症实质上是失控的炎症反应和凝血紊乱。脓毒症时炎性细胞和多种炎症介质的释放,激活了凝血系统。炎症反应和凝血激活相互促进、相互影响,使得凝血功能进一步恶化,表现为微血管内微血栓形成,导致微循环障碍,进一步发展为严重脓毒症和脓毒性休克。脓毒症凝血功能障碍是指全身广泛的凝血激活并伴随着极高的出血风险及器官功能衰竭,主要特点是血管内纤维蛋白的形成和清除的失衡,表现为凝血反应增强,抗凝血能力严重减弱,纤维蛋白溶解能力明显下降,同时伴随凝血因子与抗凝物质的大量消耗。凝血功能障碍贯穿脓毒症的整个病理过程,在其中扮演了重要角色,是脓毒症发生发展及预后的关键环节之一。脓毒症导致的凝血功能障碍主要是通过凝血激活、生理抗凝机制下调及纤溶途径抑制导致的。目前认为,组织因子(tissue factor,TF)触发的外源性凝血途径是脓毒症凝血激活的主要途径。脓毒症时TF主要来源于血管内皮细胞或单核细胞,TF激活循环中的Ⅶ因子并与之结合形成的TF-Ⅶa复合物,随后可通过级联反应使凝血酶原大量激活成为凝血酶。同时,多种途径导致生理性抗凝机制的下调,是导致凝血的另一重要因素。正常机体主要有3个生理性抗凝途径:抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,ATⅢ)、蛋白C(protein C,PC)系统和组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI),脓毒症时上述抗凝途径均受到了明显抑制。凝血激活后,纤溶系统也随之激活,而脓毒症时,由于纤溶酶原激活物被大量产生的纤溶酶原激活物抑制剂-1灭活,导致纤溶系统受到抑制。内皮细胞衬于血管内表面,能够表达多种与抗凝相关的成分,其结构和功能的完整性有助于维持血管内环境稳定,对调节血管张力、维持凝血/抗凝的平衡对及免疫功能等均具有重要意义。糖萼是血管内皮细胞内侧覆盖着的绒毛状多糖-蛋白复合结构,作为内皮细胞表层的骨架结构,强烈影响内皮细胞的功能。糖萼在血-组织通透性屏障的形成中扮演着重要角色,能够调节血细胞与内皮细胞的相互作用,为维持血管内皮细胞正常结构功能所必需。同时,糖萼在调节血管张力和抑制血管内凝血中也发挥着重要作用,生理条件下,血管内皮糖萼上结合着ATⅢ、HCⅡ、TM和TFPI等抗凝血因子,使得生理条件下的内皮细胞具有抗凝特性。脓毒症本质上是过度的炎症反应和凝血紊乱。当前认为,血管内皮细胞是炎症反应的主要靶细胞之一,同时可作为一种效应细胞,在微循环障碍、脓毒性休克及多器官功能损伤中起重要作用。脓毒症时,由于LPS和炎症细胞释放的大量TNF-α、IL-6等炎症因子,内皮细胞在其刺激下发生形态及功能上的改变,大量合成释放TF,激活外源性凝血反应,同时抗凝物质表达降低。在此炎症过程中血管内皮糖萼先于内皮细胞本身,最先受到累及和破坏。对于脓毒症凝血功能障碍而言,炎症因子和LPS导致的内皮细胞损伤是凝血激活的起始,而糖萼作为内皮细胞的保护层先于内皮细胞受到破坏,成为引发后续失控的炎症反应和凝血紊乱的门户环节,理应受到重视。肝素作为经典的抗凝药物,被熟知且广泛应用。近年来还发现肝素对脓毒症时的糖萼损伤有保护作用。一直以来,肝素也用于脓毒症时的抗凝治疗,但存在出血风险。HP-sp是肝素经过高碘酸氧化、硼氢化钠还原,制备得到的部分糖醛酸开环衍生物。本课题组之前的研究表明,HP-sp能够有效减轻脓毒症导致的糖萼损伤,那么可以推测,该保护作用可能有助于减轻脓毒症时的凝血障碍,发挥抗凝作用,这对于脓毒症的治疗有积极意义。因此,本课题拟以肝素作为对照,探讨HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的作用和可能的机制。本课题的主要成果有:1.肝素衍生物HP-sp的制备和体外抗凝活性研究1.1肝素衍生物HP-sp的制备和结构确证通过对肝素进行高碘酸钠氧化和硼氢化钠还原,制得HP-sp,并对其进行1H-NMR检测。结果表明,肝素1H-NMR谱中在δ3.40左右有Glc的邻二羟基的C2-C3H2,H3信号,而HP-sp的1H-NMR谱中该信号消失,与发生的反应相一致。除此之外,HP-sp的结构与肝素相比,无明显差异。1.2羊血浆法测定肝素衍生物HP-sp的抗凝效价采用羊血浆法考察HP-sp对复钙羊血浆凝固的抑制作用,评估其体外抗凝活性。结果测得HP-sp的抗凝效价为18.4U/mg,不足肝素的10%。2.肝素衍生物HP-sp对脓毒症小鼠高凝状态的治疗作用2.1 HP-sp对脓毒症小鼠尾出血时间的影响采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠伴高凝状态模型,以肝素为对照,考察HP-sp对脓毒症小鼠凝血时间的影响。结果发现,与正常对照组比较,LPS模型组在造模5h后尾出血时间明显缩短(P<0.05);与LPS模型组比较,肝素组和HP-sp组的尾出血时间明显延长(P<0.01);肝素组与HP-sp组相比,两组的尾出血时间无显著性差异(P>0.05)。肝素组与HP-sp组小鼠尾出血时间较正常组显著延长(P<0.05)。这表明,LPS复制的小鼠脓毒症模型呈高凝状态;肝素能发挥显著的纠正脓毒症小鼠血液高凝的作用;本课题制备的体外弱抗凝活性的HP-sp也能够显著改善脓毒症小鼠的血液高凝状态,且与肝素组无显著差异。2.2 HP-sp对脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量的影响采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠伴高凝状态模型,以肝素为对照,考察HP-sp对脓毒症小鼠外周血中D-二聚体(凝血功能紊乱的早期敏感指标)含量的影响。结果发现,与正常对照组比较,LPS模型组小鼠在造模5h后血浆中D-二聚体含量明显升高(P<0.05);与LPS模型组比较,肝素组和HP-sp组小鼠血浆中D二聚体含量明显降低(P<0.05);肝素组与HP-sp组相比,两组的血浆中D-二聚体含量无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组相比,肝素组和HP-sp组血浆中D-二聚体含量虽然略有升高,但无显著性差异(P>0.05)。这表明,LPS复制的脓毒症模型小鼠血浆中D-二聚体含量显著升高,HP-sp能够显著降低脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量,其作用强度与肝素类似,二者均可使脓毒症小鼠血浆中D-二聚体含量降低至正常水平。3.肝素衍生物HP-sp对凝血酶的抑制作用3.1 HP-sp通过ATⅢ对Ⅱa的抑制活性以肝素为对照,用生色底物法在分子水平考察HP-sp通过ATⅢ对凝血酶活性的抑制作用。结果表明,HP-sp没有激活ATⅢ并灭活Ⅱa的能力。3.2 HP-sp通过HCⅡ对凝血酶的抑制作用以肝素和硫酸皮肤素(DS)为对照,用生色底物法考察HP-sp通过HCⅡ对凝血酶活性的抑制作用。结果表明,HP-sp能激活HCⅡ,从而抑制凝血酶。4.肝素衍生物HP-sp对脓毒症小鼠的内皮保护作用TF、TFPI、sTM、sEPCR均与内皮细胞的结构完整性和功能状态相关,采用腹腔注射LPS复制脓毒症小鼠模型,用ELISA方法测定脓毒症小鼠外周血中这四种成分的含量,考察HP-sp对脓毒症小鼠内皮损伤的保护作用。4.1 HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TF含量的影响TF系脓毒症凝血激活的触发因素。结果发现,与正常组相比,LPS组小鼠血浆中TF含量明显升高,在造模后3～11h期间含量几乎没有显著变化,始终维持在高水平;与LPS组相比,造模后3h,肝素组和HP-sp组的TF含量与LPS组接近,但之后呈现明显下降的趋势,7h时两组TF含量均已低于LPS组,11h时肝素组TF含量已接近正常组。这表明,肝素和HP-sp均能降低脓毒症小鼠血浆中TF含量。4.2 HP-sp对脓毒症小鼠血浆中TFPI含量的影响TFPI系TF的天然抑制剂,是机体生理抗凝的主要成分之一。结果发现,与正常组相比,LPS组在造模后3h,TFPI含量明显升高,而在3～11h期间,LPS组TFPI含量直线下降;与LPS组相比,肝素组在3～7h期间,TFPI含量与LPS组相似,但在7～11h期间,TFPI含量明显高于LPS组,下降趋势较为平缓;与LPS组相比,HP-sp组在3～7h期间TFPI含量较低,但呈现显著升高的趋势,在7h后含量变化并不明显,但显著高于LPS组,11h时,HP-sp组含量仍高于HP组。这表明,HP和HP-sp均能使脓毒症小鼠血浆中TFPI含量升高。TFPI/TF比值的变化显示,与正常组相比,LPS组的TFPI/TF比值在3h略有升高,3～7h内基本不变,但在7～11h显著下降;与LPS组相比,3～7h内,HP组和HP-sp组比值呈现上升趋势,HP-sp组在7h时已明显高于LPS组,之后比值基本不变,而HP组始终呈现上升趋势,11h时明显高于LPS组。这表明,HP和HP-sp均能使脓毒症小鼠血浆中TFPI/TF的比值明显增大。4.3 HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sTM含量的影响sTM是TM脱落入血形成的,可作为内皮损伤的标志物。结果发现,与正常组相比,LPS组小鼠血浆中sTM含量明显升高,在造模后3～7h略有下降,7～11h期间含量几乎没有显著变化,始终维持在高水平;与LPS组相比,造模后3h,HP组和HP-sp组含量与LPS组相似,但之后呈现下降趋势,7h时HP-sp组含量已低于LPS组,11h时二者均低于LPS组,HP-sp组含量较HP组更低。这表明,HP-sp能显著降低脓毒症小鼠血浆中sTM含量,肝素作用强度较低,主要集中在7h之后。4.4 HP-sp对脓毒症小鼠血浆中sEPCR含量的影响EPCR是PC/APC的高亲和力内皮细胞表面受体,脱落入血成为sEPCR,sEPCR具有抑制APC的作用,同时也可反映内皮损伤的情况。结果发现,与正常组相比,LPS组sEPCR含量明显升高,呈现先升高后下降的趋势;与LPS组相比,肝素组和HP-sp组均呈现下降趋势,3h时HP-sp组高于LPS组,7h时两组含量均低于LPS组,7～11h期间HP组含量仍明显下降,而HP-sp组含量略微下降,11h时,肝素组含量与正常组接近,HP-sp组含量与LPS组接近,HP-sp的作用不及肝素。这表明,肝素能显著降低脓毒症小鼠血浆中sEPCR含量,HP-sp 在 3～7h 内有 明显 的降低其含量作用。5.结论HP-sp是肝素部分糖醛酸开环的衍生物,由于其结构中肝素抗凝戊糖结构破坏,HP-sp的体外抗凝性很弱,但仍能够显著改善脓毒症导致的小鼠高凝状态。研究发现,HP-sp抗凝作用主要依赖于其激活HCⅡ从而灭活凝血酶;同时,HP-sp 还能够通过对内皮细胞的保护,抑制脓毒症时凝血激活的起始环节,以及缓解脓毒症时对生理抗凝途径的抑制(TFPI和PC系统),从而发挥抗凝作用。本研究为HP-sp发展成为脓毒症抗凝治疗崭新机制的药物奠定了基础。