白喉毒素（Diphtheria toxin,DT）是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子量为58342da的外毒素，它通过灭活真核细胞的肽链延长因子Ⅱ（EF-2），阻断细胞蛋白合成，导致细胞死亡。毒素经胰蛋白酶水解分成193个氨基酸残基的A片段和342个氨基酸残基的B片段，A片段分子量为22KDa，位于毒素氨基末端，它进入细胞内可以催化ADP-核糖基化，灭活真核细胞的延长因子Ⅱ（EF-2），另外它激活一组半胱氨酸酶（Caspases），这一组半胱氨酸酶（Caspases）可以催化断裂一类酶-如核酸修饰酶中的多（ADP-核糖）聚合酶（PARP），而引起细胞凋亡；B片段分子量为38KDa，位于羧基末端，由跨膜、转位、受体结合区组成。表皮生长因子是一种多功能的细胞因子，可由多种细胞产生。在一些肿瘤细胞表面，（骨髓瘤、原发性肝癌、前列腺癌、鳞状上皮癌）EGF受体呈过度表达，显著高于毗邻组织的正常细胞。这种EGF受体数量上的显著差异及受体与配体的特异性结合为杀伤肿瘤细胞药物的定向导入提供一可资利用的途径。基于上述认识，我们选用白喉毒素作为细胞杀伤组分，EGF作为向肿瘤细胞定向运送药物的载体。用EGF的cDNA取代白喉毒素的受体结合区基因，构建了白喉毒素-表皮生长因子(DAB389-EGF)融合基因及白喉毒素-Linker-表皮生长因子(DAB389-（Gly4Ser）2-EGF)融合基因，经限制性内切酶消化后，挑选酶切正确的质粒，即为pDE及pDLE重组质粒。采用Sanger’s双脱氧末端终止法，用T7 DNA聚合酶通用引物对重组质粒中的插入片段进行核苷酸序列测定。将两种表达质粒分别转化至表达宿主菌E.coli BL21（λDE3）中并进行了表达，以仅含pET28a（+）质粒的受体菌作对照，SDS-PAGE结果显示pDE及pDLE重组质粒均能明显表达出分子量约等于50KD的外源蛋白，表达产物主要为胞内可溶形式存在。凝胶薄层扫描分析显示表达产物占菌体总蛋白的23.64％和22.15％。表达产物经Western免疫印记和胰蛋白酶酶切实验证明了融合蛋白的正确性。表达产物经硫酸铵分步沉淀法、Octyl Sepharose 4 Fast Flow疏水作用色谱、DEAE Sepharose 4 Fast Flow阴离子交换色谱、Red Affinity 4 Fast Flow亲和色谱、Sephacryl 200凝胶过滤层析纯化，目的蛋白纯度达到96％。该融合蛋白在细胞水平上证实了EGF受体结合能力及对人肝癌细胞系HepGZ，人肺腺癌细胞系A549，人胃癌细胞系BGC｛23，人结肠癌细胞系HCTE，人乳腺癌细胞MDA，喉癌细胞系HepZ，鼠骨髓瘤细胞一川等7种肿瘤细胞具有极强的抑瘤作用，XTT法结果显示DAB3的一＜Gly在er)Z－EGF对不同肿瘤细胞的IC50为0．lI0pM，而对人体正常细胞在50pM时未表现出细胞毒性作用。同时证明DABsso－（Gly。Ser）。－EGF的细胞毒性是DAB389WGF的3～5倍。本研究为开发一种新的导向抗肿瘤药物打下了基础。