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多脊椎现象是存在于河北小尾寒羊中的有益突变,多数突变都会引起绵羊脊柱的加长和体尺增加,从而显著提高产肉量。本论文采用PCR-RFLP、Dcaps、PCR-SSCP以及直接测序等技术首次从分子水平上对小尾寒羊的Btg2基因和NR6A1基因的多态性与多脊椎性状的关系进行研究,以期找到与小尾寒羊多脊椎突变相关的分子遗传标记,并为进一步标记辅助选择提高河北小尾寒羊的肉用性能,培育我国肉用绵羊品种奠定基础。
根据牛和猪的Btg2基因的DNA序列,选择保守区域设计引物,扩增绵羊Btg2基因的外显子3和3′UTR的部分序列,并对这些序列选取代表性个体进行测序,得到长度为1226bp的片段。全部片段测序结果经过同源性比对,共发现4个SNPs位点,突变位点依据拼接序列来命名分别为:A150G、C243T、A607G和T704C,其中有1个SNPs位于外显子,未引起氨基酸序列的改变。
应用PCR-RFLP及Dcaps技术,对Btg2基因的A150G、C243T和A607G突变位点分别设计引物进行PCR扩增和群体检测。独立性卡方检测结果表明150位点的不同表型个体基因型频率差异不显著(P>0.05);243位点的差异极显著(P<0.01),卡方检验再分割结果表明,基因型频率在T14L6与T14L7、T14L5表型之间差异极显著,T14L6与T13L7之间差异显著;607位点的差异呈显著水平(P<0.05),卡方检验再分割表明基因型频率在T14L6与T14L7中差异显著。结果表明243位点、607位点可能与多脊椎性状有关。经过独立性卡方检验,表明单体型在不同表型中差异显著(P<0.05),分析表明单体型GTA可能与多脊椎性状有关。
根据牛和猪的NR6A1基因的DNA及Mrna序列,设计8对引物,扩增绵羊的该基因的全部编码区序列。运用PCR-SSCP以及直接测序技术对扩增产物进行突变筛查,结果在外显子5的第25位碱基处上检测到1个T25G的单碱基突变,该突变未引起氨基酸序列的改变。对该位点进行群体检测分型,经独立性卡方检验后,发现基因型频率在5种不同多脊椎突变表型间差异达到显著水平(P<0.05),卡方检验再分割后发现基因型频率在T14L5与T14L6以及T14L5与T14L7中差异显著,表明该位点可能与多脊椎性状有关。