电离辐射指能使物质发生电离现象的辐射,如α粒子、β粒子、X射线以及γ射线等。目前电离辐射已经被广泛应用于核能发电、疾病治疗和诊断、农作物育种、金属勘探和科学研究等领域。其在造福人类的同时,也使人类接触辐射的机会大大增加,严重威胁着人们的健康,甚至生命。辐射损伤的机制极其复杂,其中辐射诱导产生的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)是诱发辐射损伤的主要机制。因此,生物体内最重要的ROS高效清除剂——超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)被公认为是最理想的辐射防治药物。但是,天然SOD存在稳定性差、体内半衰期短、细胞亲和力差和异源酶容易引起免疫反应等缺陷,限制了它的临床应用。因此,本课题在前期研究的基础上,首次利用一种新型的6-0-季铵化壳聚糖衍生物——6-O-2’-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(6-O-2’-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan, O-HTCC)对SOD的末端羧基进行结构修饰,并经一步纯化制备了O-HTCC-SOD;采用SDS-PAGE、 SEC-HPLC、圆二色谱、粒径/电位分析和电镜扫描等对O-HTCC-SOD的主要理化性质进行了分析；邻苯三酚比色法测定了pH值、温度及蛋白水解酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)对O-HTCC-SOD酶活性的影响,以及α淀粉酶降解O-HTCC对O-HTCC-SOD酶活性的影响；然后应用优化的MTT法体外评价了O-HTCC-SOD对小鼠肺成纤维细胞L929和胚胎成纤维细胞3T3的辐射防护作用；采用总SOD测试盒检测尾静脉给药后小鼠外周血和肝、肾组织中O-HTCC-SOD的活性,并通过DAS 2.0软件计算其基本药代动力学参数；参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,完成了O-HTCC-SOD对小鼠辐射损伤防护作用的评价。本论文的取得的研究成果如下：1.6-O-季铵化壳聚糖衍生物O-HTCC的制备通过三步化学反应将季铵基团侧链接枝到C6位的羟基上,并经一步超滤纯化得到水溶性好的季铵化壳聚糖衍生物O-HTCC,产率为92.0%。IR和1H NMR分析表明O-HTCC结构与预期相符,茚三酮比色法测定O-HTCC的自由氨基率为73.35%。O-HTCC兼具水溶性好和自由氨基含量高的优点,更适合用于后续的SOD结构修饰。2. O-HTCC-SOD的制备、分离纯化和性质分析以EDC/NHS作为偶联剂,经SOD的羧基活化和与O-HTCC形成酰胺键两步反应实现对SOD的末端羧基的结构修饰,修饰率超过90%。经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂分离纯化,最终得到O-HTCC-SOD精品。SDS-PAGE和SEC-HPLC分析表明O-HTCC-SOD分子量明显大于天然SOD且呈宽的连续分布；圆二色谱分析表明O-HTCC-SOD二级结构中的优势构象变化较小,空间排列比SOD更加规则、有序；粒径分布和电镜扫描分析表明O-HTCC-SOD保持SOD的球状结构,但粒径显著大于SOD,；电位分析表明O-HTCC-SOD带较多的正电荷。3. O-HTCC-SOD的酶学性质研究采用邻苯三酚法测定了O-HTCC-SOD在不同pH、温度以及含胃蛋白酶、胰蛋白酶的条件下的酶活变化,结果显示：在pH为3或11时,O-HTCC-SOD的酶活保留率显著高于天然SOD；温度稳定性试验表明O-HTCC-SOD在40-C-70-C的高温度范围内稳定性优于天然SOD；蛋白酶降解实验中,在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下,天然SOD酶活保持率明显下降,O-HTCC-SOD活性基本稳定或略微有所上升。因此,SOD被O-HTCC修饰后,所得结合物具有更宽的pH适应范围、更好的热稳定性和更强的抗蛋白酶降解能力,表明共价结合于SOD表面的高分子聚合物O-HTCC显著提高了SOD的稳定性。此外,在确定壳聚糖的衍生物O-HTCC具备生物可降解的基础上,我们还证明：α淀粉酶具有持续提高O-HTCC-SOD酶活性的特点。推测可能是α淀粉酶缓慢水解了SOD结合物表面的O-HTCC,使原来被O-HTCC部分封闭的SOD活性位点充分暴露,从而表现出更强的酶活性。因此,结合物具有α淀粉酶介导的酶活性缓释特性。4. O-HTCC-SOD的体外辐射保护作用评价以L929细胞为研究对象,通过MTT实验筛选合适的O-HTCC-SOD给药剂量,并评价其对两种细胞的辐射损伤保护作用。结果表明,L929细胞对O-HTCC-SOD的最大耐受剂量为250 U/mL；O-HTCC-SOD对上述细胞系具有一定的保护作用；在一定时间内,α-淀粉酶通过缓慢降解O-HTCC-SOD中的O-HTCC使结合物表现出持续增强的细胞辐射保护作用。此外,初步研究发现O-HTCC-SOD可与L929细胞结合,入胞能力显著增强。5. O-HTCC-SOD在小鼠体内的药代动力学初步研究采用总SOD检测试剂盒对小鼠静脉单次给药的药代动力学研究,结果表明,天然SOD体内药动学行为符合常规二室模型,而O-HTCC-SOD与常规的静脉给药模型不符,其浓度-时间曲线呈“几”字形；O-HTCC-SOD在体内分布半衰期为1.25 h,显著长于天然SOD(0.25 h)；O-HTCC-SOD生物利用度较天然SOD也略有提高；通过对血药浓度达峰时间(Tmax)以及最大血药浓度的比较,初步确定结合物在体内表现出一定的缓释特性。肝脏中SOD以及O-HTCC-SOD浓度-时间变化曲线表明SOD在肝脏被迅速清除,O-HTCC-SOD则先在肝脏快速聚集,然后缓慢清除,提示O-HTCC-SOD表现出一定的肝靶向性。肾脏中SOD和O-HTCC-SOD浓度-时间曲线差别较小,表明O-HTCC对SOD的修饰对该在肾脏的聚集和清除影响较小。6. O-HTCC-SOD的体内辐射保护作用评价用BALB/c小鼠作为实验对象,评价了高、中、低剂量O-HTCC-SOD对对8 Gy X射线照射诱导的急性辐射损伤防护作用。采用全自动血液分析仪对各组小鼠进行外周血象分析,正常小鼠经辐射照射后白细胞数迅速下降,同时红细胞和血小板数变化较小,表明急性辐射损伤对与白细胞功能相关的免疫系统等功能影响较大。高剂量O-HTCC-SOD组能够使照射小鼠外周血白细胞恢复到正常水平,中、低剂量组及SOD组亦表现出显著的辐射损伤防护作用(P<0.05)。胸腺指数和脾指数测定结果表明,辐射导致小鼠的胸腺指数和脾指数均明显减小；高、中剂量结合物组与阴性组相比,胸腺指数和脾指数都显著增大(高剂量组P<0.01,中剂量组P<0.05)；SOD阳性组和O-HTCC组对胸腺指数和脾指数保护作用不明显。微量丙二醛(MDA)试剂盒测定肝脏、肺MDA含量,结果表明,O-HTCC-SOD对肝脏和肺部因脂质过氧化产生的MDA具有有效的清除作用,并呈现出明显的剂量依赖性,SOD的清除作用不明显。对各组小鼠小肠、肝脏和肺组织制作病理切片并进行HE染色,结果表明,O-HTCC-SOD对这三种器官均具有明显的辐射损伤防护作用,并且具有浓度依赖性,SOD也没有起到明显的保护作用。因此,O-HTCC-SOD对X射线照射诱导的小鼠急性辐射损伤具有显著的防护作用,并呈剂量依赖性。总之,SOD经壳聚糖的衍生物O-HTCC修饰,得到的结合物的理化性质、酶学特性和体内药代动力学行为均得到明显改善,体内外防辐射损伤作用显著增强,是一种具有研究和开发价值的防辐射损伤创新药物。